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TítuloIdentificação de bactérias filamentosas em processos de lamas activadas através da técnica de hibridização in-situ de fluorescência (FISH)
Autor(es)Abreu, A. A.
Orientador(es)Alves, M. M.
Data2004
Resumo(s)O presente trabalho incidiu na aplicação de técnicas moleculares na monitorização da biodiversidade microbiológica num processo de lamas activadas, de uma estação municipal de tratamento de águas residuais (ETAR). A técnica molecular de hibridização in situ de fluorescência (FISH) foi optimizada para a identificação de algumas bactérias fialmentosas, causadoras de “bulking” e “foaming”. A informação obtida a partir da técnica de FISH foi comparada com as técnicas clássicas de identificação, baseadas em descrições morfológicas e resposta a colorações de Gram e Neisser. Foram avaliadas as limitações inerentes a cada uma das técnicas com vista à sua potencial aplicação de uma forma rotineira em ETAR’s. Os dados de operação da ETAR foram relacionados com a biodiversidade microbiana e calculou-se o Índice Biológico de Lamas (IBL), de forma a complementar a informação a nível da actividade biológica e eficácia depuradora da ETAR. As técnicas clássicas baseadas nas colorações revelaram-se de fácil aplicação e de rápida implementação, apesar das limitações encontradas, a nível da subjectividade da observação e das variações de reacção à coloração originadas pelos factores ambientais inerentes. Para além das limitações referidas anteriormente, existem também algumas imprecisões nos manuais de identificação, verificando-se que estes diferem em alguns casos de autor para autor. A técnica de hibridização in situ de fluorescência permitiu a identificação de bactérias filamentosas num ambiente complexo, como o caso das lamas activadas, apesar de algumas dificuldades sentidas. A principal teve a ver com a escolha das sondas e com a optimização das condições de hibridização específicas para cada sonda. Inicialmente foram testadas cinco sondas: HHY, GOR0596, MPA645, CHL1851, EUB338 específicas respectivamente das bactérias Haliscomenobacter hydrossis, Gordona, Microthrix parvicella, Tipo 1851 e maior parte do domínio bactéria. Mais tarde, devido à ausência de resultados com a sonda GOR0596, foi testada uma nova sonda (MNP1), específica para a maior parte dos Nocardioformes. A utilização da MPA645 não permitiu a visualização dos filamentos de Microthrix parvicella, mesmo depois de aumentada a permeabilidade das células através de pré-tratamentos com lisozima e mutanolisina. Isto sugere que esta sonda não é indicada para a identificação da Microthrix parvicella existente nas amostras analisadas. Existem outras sondas nomeadamente: a MPA60, MPA223 e MPA650 específicas para Microthrix parvicella, que em trabalhos futuros poderão ser testadas separadamente ou mesmo em conjunto. A sonda CHL1851 também não permitiu a identificação da bactéria Tipo 1851. Dado que actualmente esta é a única sonda para este tipo bacteriano, não foi possível concluir acerca da sua presença nas amostras analisadas. Outro aspecto limitante teve a ver com a qualidade das imagens adquiridas, o que possivelmente teve origem na potência da fonte de luz do microscópio de fluorescência que não era a adequada. De uma forma geral muito trabalho necessita ainda de ser desenvolvido a nível da identificação e classificação filogenética das bactérias filamentosas, de forma a permitir o desenvolvimento de novas sondas mais específicas. Do ponto de vista prático conclui-se que a técnica de FISH requer uma metodologia não muito fácil de aplicar, de uma forma rotineira, em sistemas de tratamento de água residuais. É necessário uma maior confiança no método para que se torne mais fácil a sua aplicação de uma forma sistemática.
This work was focused on the application of molecular techniques for monitoring the microbial biodiversity in activated sludge processes. Fluorescent in situ hybridization (FISH) technique was optimized for the identification of some filamentous bacteria responsible for the bulking and foaming events in such processes. The information obtained by FISH was compared with the classical techniques based on moorphological descriptions and stainning reactions, such as Gram and Neisser. The limitations associated to both techniques and the potential sistematic applicability in wastewater treatment plants were evaluated. The microbial biodiversity was related to the operational performance of the wastewater treatment plant and the sludge biotic index (SBI) was calculated, to complete the information about the biological activity and plant performance. The classical techniques, based on staining reactions, were easy and fast, but some limitations were found such as some subjectivity and the fact that environmental conditions may affect the reaction to the staining. Another problem related to the classical approach, is some ambiguity in identification manuals, since different authors present different conclusions. FISH allowed the identification of filamentous bacteria in the complex environment of activated sludge, although some difficulties were found. One of the main problems was the difficulty to select the most appropriate probes. Initially, five probes were used: HHY, GOR0596, MPA645, CHL1851, EUB338. These probes were specific to Haliscomenobacter hydrossis, Gordona, Microthrix parvicella, Type 1851 and bacteria domain, respectively. No results were obtained using probe GOR0596, and a new probe was tested, MPN1, specific to most Nocardioforms. Microthrix parvicella could not be detected with the probe MPA645, even after permeabilization of the cell membrane with lisozyme and mutanolysine treatments. This suggests that in our environmental samples, the probe MPA645 is not adequate. Other probes, like MPA60, MPA223 or MPA650, should be tested in future studies, to verify the viability of these probes in activated sludge samples. Also Type 1851 was not identified using the probe CHL1851. Since this probe is the only one known for this bacteria type, no conclusion could be withdrawn about the presence of Type 1851 in the studied samples. Another problem found in FISH analysis was the low quality of the images obtained, due to the low intensity of the microscope light used in this study. In a global way, there is still a lot of work to be developed in the area of identification and filogenetic classification of filamentous bacteria, in order to allow the development of new probes with applicability in activated sludge. From the practical viewpoint, we can conclude that FISH is not yet an easy technique to apply in this type of environmental samples. In order to apply FISH routinely, more confidence in the probes used is necessary.
TipoDissertação de mestrado
URIhttps://hdl.handle.net/1822/575
AcessoAcesso aberto
Aparece nas coleções:BUM - Dissertações de Mestrado
CEB - Dissertações de Mestrado / MSc Dissertations

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