Metabolic engineering of acetyl-CoA Carboxylase in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Saccharomyces cerevisiae is one of the most studied microorganisms and one of the most used cell factories for the production of compounds with pharmacological value. The low intracellular concentration of Malonyl coenzyme A (malonyl-CoA) limits the ability of this yeast to produce malonyl-coA derived products such as flavonoids, polyketides and biodiesel. In this yeast, the only source of malonyl-CoA is the ATP-dependent carboxylation of acetyl coenzyme A (acetyl-CoA) catalyzed by acetyl-CoA carboxylase (ACC), the rate-limiting step in fatty acid biosynthesis. In this work, expression of heterologous ACCs in S. cerevisiae was attempted with the objective of establishing alternative malonyl-CoA production systems in this yeast. A S. cerevisiae strain with a tetracycline repressible ACC1 was used for functional testing. Since ACC1 is an essential gene, this strain is not capable of growing in medium supplemented with tetracycline. Expression of S. cerevisiae or Yarrowia lipolytica ACC1 from a plasmid complemented the conditional phenotype and enabled growth in tetracycline containing medium. A plasmid expressing 4 genes coding for the Arabidopsis thaliana plastidic ACC subunits was unable to complement the phenotype. Expression of ACCs from plasmids caused prolonged lag phase, and specific growth rates were considerably lower than the ones obtained for the wild type strain. This result is consistent with previous studies where ACC activity was increased and likely results from the metabolic imbalance this increase might cause.

Saccharomyces cerevisiae é um dos microrganismos mais estudados e uma das fábricas celulares mais usadas na produção de compostos com valor farmacológico. A baixa concentração intracelular de malonil coenzima A limita a capacidade que esta levedura tem de produzir derivados deste metabolito, como flavonóides, policetídeos e biodiesel. Nesta levedura, a única fonte de malonil-coA é a carboxilação dependente de ATP de acetilcoenzima A realizada por acetyl-coA carboxylase (ACC), o passo limitante na biossintese de acidos gordos. Neste trabalho, foi tentada a expressão de ACCs heterologos em S. cerevisiae com o objectivo de estabelecer sistemas alternativos de produção de malonil-coa nesta levedura. Uma estirpe de S. cerevisiae com um ACC1 repressível foi usada para testes funcionais. Dado que ACC1 se trata de um gene essencial, esta estirpe é incapaz de crescer num meio suplementado com tetraciclina. A expressão do ACC1 tanto de S. cerevisiae como de Yarrowia lipolytica a partir de um plasmídeo complementou o fenótipo condicional e permitiu o crescimento num meio contenod tetraciclina. Um plasmídeo de expressão que codifica 4 genes codificantes para a subunidades da ACC plastídica de Arabidopsis thaliana foi incapaz de complementar o fenótimo. A expressão de ACC1 a partir de plasmídeos causou um fase de adaptação prolongada, e as taxas específicas de crescimento foram consideravelmente menores que as obtidas para a estirpe wild type. Este resultado é consistente com estudos anteriores onde a actividade de ACC foi aumentada e resulta, provavelmente, do imbalanço metabólico que este aumento pode causar.