Exploring yeast as a tool to study the regulation of the human pro-apoptotic protein Bax

Abstract

Cell death has long been considered crucial for proper tissue shaping during embryonic development and for normal turnover of the cells in several tissues. Moreover, mis-regulation of apoptosis has been implicated in a diversity of abnormal functions and in the progression and development of diseases. Indeed, a decrease in apoptosis has been associated with ageing and tumour progression, whereas an increase in apoptosis is mainly associated with ageing-related neurodegenerative diseases including Alzheimer’s, Parkinson’s and Huntington’s diseases. The life and death switch is among others regulated by interactions between pro- and anti-apoptotic Bcl-2 family members, including Bax and Bcl-xL, respectively. Bax plays a central role in apoptosis, as it is involved in the formation of pores within the mitochondria outer membrane through which apoptogenic factors, including cytochrome c, are released and originate a cascade of events that culminate in cell death. Given the importance of this pro-apoptotic protein in cell death, its potential as a therapeutic target was quickly recognized, and its mode of action and regulation have been studied extensively. However, many questions still remain, and thus further understanding of Bax regulation was the general purpose of this thesis. To accomplish this, we took advantage of the genetically tractable yeast Saccharomyces cerevisiae, whose genome is devoid of genes coding apparent homologues of the human Bcl-2 family. Therefore, the heterologous expression of human Bax allows its study without interference of the apoptotic network. To achieve our goal, we first optimized the conditions for expression of human Bax (Bax α) in yeast and characterized the phenotype of expression of Bax α and of an active form, Bax c-myc. Then, conditions that led to Bax α activation were found, and its regulation through different proteins was explored. Herein, we describe for the first time that sub-lethal concentrations of acetic acid trigger Bax α-mediated cell death without disturbing plasma membrane integrity and mitochondrial mass but increasing superoxide anion accumulation and release of cytochrome c, which is partially reverted by the anti-apoptotic protein Bcl-xL. This finding allows us to mimic what happens in human cells, without the need to use non-natural mutants of Bax, such as phosphomimetic or non-phosphorylatable, or mitochondrial tagged versions. Thus, yeast continuously proves to be a valuable tool to express human Bax and perform studies regarding its function, regulation and interaction with other members of the Bcl-2 protein family and other partners.

A morte celular é um evento fundamental para a correta formação dos tecidos durante o desenvolvimento embrionário e para o normal funcionamento das células. Devido ao seu papel fundamental a nível fisiológico, desregulações neste processo estão associadas a uma grande diversidade de funções anormais e, consequentemente, ao desenvolvimento e progressão de várias doenças. De facto, uma diminuição da morte celular relaciona-se com envelhecimento e a progressão de tumores, enquanto que um aumento está associado a doenças neurodegenerativas incluindo a doença de Alzheimer, Parkinson e Huntington. O destino de uma dada célula é regulado, entre outras formas, por interações entre membros pro-apoptóticos e anti-apoptóticos da família de proteínas Bcl-2, nomeadamente a Bax e a Bcl-xL, respetivamente. A proteína Bax está envolvida na formação de poros na membrana mitocondrial externa, através do qual são libertados fatores apoptóticos, incluindo o citocromo c, originando uma cascata de eventos que culmina na morte da célula. Considerando o papel importante desta proteína na morte celular, as suas capacidades como alvo terapêutico emergiram rapidamente. Por este motivo, o seu modo de ação e regulação têm sido extensivamente estudados. Contudo, várias questões permanecem eminentes e, por isso a melhor compreensão da sua regulação é o foco principal desta tese. Assim, escolhemos a levedura Saccharomyces cerevisiae, cujo genoma não possui genes codificantes de homólogos da família de proteínas humanas Bcl-2. Deste modo, a expressão heteróloga da proteína Bax humana na levedura permite o seu estudo sem interferência dos restantes membros da família. Para alcançarmos o nosso objetivo, primeiramente otimizamos as condições para expressão da proteína na levedura, e caracterizamos o seu fenótipo de expressão, bem como o de uma forma ativa, Bax c-myc. De seguida, determinamos condições que nos permitiram a ativação da proteína Bax humana e a sua regulação por outras proteínas. Nesta tese, descrevemos pela primeira vez que concentrações sub-letais de ácido acético desencadeiam um processo de morte celular mediado por Bax, sem provocar alterações na integridade da membrana plasmática e na massa mitocondrial, mas aumentando a acumulação de anião superóxido e causando a libertação de citocromo c, parcialmente revertida pela proteína anti-apoptótica Bcl-xL. Estes resultados permitiram-nos mimetizar o que acontece em células humanas, sem a necessidade de usar mutantes de Bax artificiais, tais como os mutantes fosfomiméticos e não fosforiláveis ou versões endereçadas para a mitocôndria. Deste modo, a levedura continua a revelar o seu valor como modelo celular para expressar a proteína Bax humana e realizar estudos no que toca à sua função, regulação e interação com outros membros da família Bcl-2 e outros parceiros.