Development of a molecular biology platform for the production of antimicrobial peptides

Abstract

Antimicrobial peptides (AMPs) are important antibiotic candidates due to their reduced or even absent propensity to induce development of resistance from microbes. This fact is important due to the rise of multi-resistant bacteria. This work aims at developing a platform for the production and purification of AMPs using elastin-like polypeptides (ELPs) for the non-chromatographic purification and inteins as self-cleaving tags for the isolation of the AMPs. As general molecular cloning strategy, different adapters (total of nine) were designed and used for the genetic construction of four different expression vectors. Two vectors, named pA1C and pA3N, were designed to insert both ELP (A60) and different AMPs (ABP-CM4; HAMP; BMAP-28) on different sides of the intein. The vector pA1C uses a mutant intein ΔI-CM with the N-terminal cleavage blocked by a point mutation. The pA3N vector, on the other hand, uses a mutant intein ΔI-SM with the C-terminal cleavage blocked by a point mutation. Both inteins are mutants of the Mtu recA intein. As proof of concept for the molecular design, the ABP-CM4 peptide was inserted at the C-terminal in the pA1C vector and at the N-terminal in the pA3N vector. Following genetic constructions, the fusion proteins were expressed in E. coli BL21(DE3) and purified by inverse temperature cycling. After purification, the N-terminal cleaving of the ΔI-SM (mutated) intein was triggered by addition of the reducing agent DTT. The C-terminal cleaving of the ΔI-CM (mutated) intein was triggered with a cleaving solution at pH 6. Although both constructions demonstrated to be able to self-cleave the AMP, the pA3N vector showed to be more promising than pA1C vector, with the latter displaying residual splicing. Additional constructions, with and without His-tags, involved the use of the split intein Npu DnaE aiming at the concatenation/multimerization of biopolymers such as ELPs and silk-elastin-like proteins (SELPs). The genetic constructions explore the use of FRB and FKBP dimerizing domains fused to split inteins to trigger splicing and concatenation after addition of rapamycin. The expression vectors were termed as pA2H (with His-tag) and pA2∅ (without His-tag). Results with A60 demonstrated the concatenation of the biopolymer leading to the formation of molecules with higher molecular weight, although at an uncontrolled rate.

Os peptidos antimicrobianos (AMPs) são importantes candidatos a antibióticos devido à baixa ou até mesmo ausente capacidade de induzir o desenvolvimento de resistências pelos microrganismos. Este facto é importante devido ao aparecimento de bactérias multirresistentes. O presente trabalho tem por objetivo a criação de uma plataforma para a produção e purificação de AMPs explorando elastin-like polypeptides (ELPs) como método de purificação não cromatográfica e inteínas como mecanismo de auto-clivagem para o isolamento de AMPs. Como estratégia geral de clonagem, foram desenhados diferentes adaptadores (total de nove) que foram utilizados para construir quatro vetores de expressão. Dois vetores, denominados de pA1C e pA3N, foram desenhados para inserir o ELP (A60) e diferentes AMPs (ABP-CM4; HAMP; BMAP-28) em cada um dos terminais da inteína. O vetor pA1C explora a utilização de uma inteína ΔI-SM mutada num aminoácido para bloquear a clivagem no N-terminal enquanto o vetor pA3N usa a inteína ΔI-SM mutada num aminoácido para bloquear a clivagem no C-terminal. Ambas inteínas são mutantes da inteina Mtu reca. Como prova de conceito, o péptido ABP-CM4 foi inserido no C-terminal do vetor pA1C e no N-terminal do vetor pA3N. Após obtenção das construções genéticas, as proteínas de fusão foram expressas em E. coli BL21 (DE3) e purificadas com recurso a inverse temperature ciclying (ITC). Depois da purificação, a clivagem no N-terminal da inteina ΔI-SM (mutada) for induzida com a adição do agente redutor DTT. A clivagem no C-terminal da inteina ΔI-CM (mutada) foi provocada com uma solução de clivagem a pH 6. Apesar de ambas as construções mostrarem a ocorrência de auto-clivagem do AMP, os resultados obtidos com a construção pA3N foram mais promissores que os obtidos com a construção pA1C, já que este último demonstrou a ocorrência de splicing residual. Adicionalmente, foram obtidas construções adicionais, com e sem His-tag, envolvendo a utilização da inteína split Npu DnaE e com o objetivo de obter a concatenação/multimerização de biopolímeros como ELPs e silk-elastin-like proteins (SELPs). Para tal, as construções genéticas exploram a utilização dos domínios de dimerização FRB e FKBP fundidos com as inteinas split, as quais, após adição de rapamicina, conduzem ao splicing e concatenação. Os vetores de expressão com e sem His-tag foram denominados por pA2H (com His-tag) e pA2∅ (sem His-tag). A análise dos resultados mostrou haver concatenação não controlada do biopolímero A60, conduzindo à formação de moléculas de maior peso molecular.