Transcriptomic and proteomic responses to silver nanoparticles in aquatic microbes

Abstract

Silver nanoparticles (AgNPs) are presently among the most widely used nanomaterials. With the extraordinary advances in nanotechnologies, enormous amounts are expected to be released into the environment and to reach freshwaters. The inherent antimicrobial properties of silver ions (Ag+) has raised concern on whether natural microbiota can be affected in the same way as pathogenic microbes. Moreover, the mechanisms of toxicity of AgNPs remain unclear particularly the discrimination of the role of Ag+ released from AgNPs in toxicity is not fully elucidated. We assessed the impacts of AgNPs and Ag+ based on omic approaches and on the activities of selected antioxidant enzymes in two aquatic fungal ecotypes of Articulospora tetracladia, one isolated from a non-polluted stream (At72) and the other from a metal-polluted stream (At61), and in the bacterial strain Pseudomonas sp. M1 (PsM1), isolated from a metal-polluted stream. At72 was the most sensitive to AgNPs, whereas PsM1 was the most tolerant one. These results were supported by data from NP characterization, which showed increased particle stability and less agglomeration in the presence of At72 that in the presence of the other tested microbes. Our results also reinforced the role of antioxidant enzymes against oxidative stress induced by both Ag forms; enzyme activities were higher i) in At72 than in At61 and ii) against Ag+ than AgNPs. Omic responses to equitoxic and environmentally realistic levels of AgNPs and Ag+ suggested different mechanisms of toxicity since distinct profiles of protein and gene expression were unveiled. In addition, gene ontology enrichment analysis further unravelled the biological processes associated with different adaptive responses in the metabolic, energetic and stress pathways which allowed discerning the effects of AgNPs from those of Ag+. For instance, proteomics revealed that DNA repair, vesiclemediated transport and protein degradation were the processes more associated with At72 responses, while redox homeostasis, energy production, ascospore formation and nucleic acids metabolism were mainly associated with the responses of At61. In PsM1, chaperones, transmembrane transporters, as well as proteins related to biofilm formation and pathogenesis were pointed as potential biomarkers of the stress induced by Ag+ and/or AgNPs. On the other hand, transcriptomics strongly suggested cellular membranes as the major targets of AgNPs and Ag+ and highlighted the processes of energy production and of steroid metabolism in response to AgNPs and Ag+, respectively. Furthermore, the negligible amount of Ag+ released from AgNPs suggests that toxicity of AgNPs was mainly attributed to the particulate form of silver.

As nanopartículas de prata (AgNPs) estão atualmente entre os nanomateriais mais amplamente usados. Com o desenvolvimento das indústrias com base nanotecnológica, é esperado que quantidades elevadas de nanomateriais sejam libertadas no ambiente, das quais uma fração considerável deverá atingir os ecossistemas de água doce. As propriedades antimicrobianas inerentes aos iões de prata (Ag+), levaram ao aumento das preocupações sobre a possibilidade da microbiota natural poder ser afetada da mesma forma que os microrganismos patogénicos. Além disso, os mecanismos de toxicidade das AgNPs ainda não estão bem esclarecidos, particularmente a questão da discriminação do papel dos Ag+ lixiviados das nanopartículas na toxicidade. Neste estudo, os impactos das AgNPs e Ag+ foram avaliados com base em abordagens ómicas e nas atividades de enzimas antioxidantes em dois ecótipos do fungo aquático Articulospora tetracladia, uma estirpe isolada de um rio não poluído (At72) e outra de um rio poluído com metais (At61), e na estirpe bacteriana Pseudomonas sp. M1 (PsM1), isolada de um rio poluído com metais. At72 foi o mais sensível a AgNPs, enquanto PsM1 foi a mais tolerante. Os resultados foram sustentados por dados da caracterização das NPs, que mostraram maior estabilidade de partículas e menor aglomeração na presença de At72 que na presença dos outros microrganismos. Os resultados reforçaram o papel das enzimas antioxidantes contra o stresse oxidativo induzido por ambas as formas de Ag; as atividades enzimáticas foram maiores i) em At72 do que em At61 e ii) contra Ag+ do que AgNPs. As respostas ómicas a níveis equitóxicos dos compostos e em concentrações ambientalmente realistas de AgNPs e Ag+ sugeriram diferentes mecanismos de toxicidade, uma vez que revelaram perfis distintos de expressão proteica e génica. Além disso, a análise de enriquecimento de ontologia génica desvendou processos biológicos associados a diferentes respostas adaptativas nas vias metabólica, energética e de stresse, o que permitiu discernir os efeitos das AgNPs dos de Ag+. Por exemplo, a proteómica revelou que a reparação do ADN, o transporte vesicular e a degradação proteica foram os processos mais associados às respostas de At72, enquanto a homeostasia redox, a produção de energia, a formação de ascósporos e o metabolismo dos ácidos nucleicos foram principalmente associados às respostas de At61. Em PsM1, as chaperonas, os transportadores transmembranares, assim como as proteínas relacionadas com a formação de biofilme e patogénese são apontados como potenciais biomarcadores do stresse induzido por Ag+ e/ou AgNPs. Por outro lado, a transcriptómica apontou as membranas celulares como os alvos principais das AgNPs e Ag+ e destacou os processos de produção de energia e do metabolismo de esteroides na resposta à exposição a AgNPs e Ag+, respectivamente. Além disso, a insignificante quantidade de Ag+ libertada das AgNPs sugeriu que a toxicidade das AgNPs esteve principalmente associada à forma particulada da prata.