Diet in prevention and treatment of colorectal cancer: the role of selected legumes of the Mediterranean diet

Abstract

Although legume intake is associated with health benefits, the consumption of Vigna unguiculata (cowpea) and several Phaseolus vulgaris varieties (common beans) has been decreasing in Mediterranean countries, where they used to be an important part of the diet, due to increasing western influence on dietary habits. In contrast with soy, which anticancer activity has been reported in different studies, little is known about legume mechanisms of health improvement, especially regarding colorectal cancer. This thesis aims therefore to provide molecular characterization of the anti-colorectal cancer of extracts from several legumes (4 varieties of Phaseolus vulgaris, Vigna unguiculata and Glycine max) using raw, processed (boiled and pressure cooked) and as 5-day old cowpea sprouts. The phenolic characterization revealed that both cooking methods (boiling and pressure) increase the total phenolic content and antioxidant activity in methanolic extracts of the four Phaseolus varieties and cowpea, comparing with the raw extracts. In contrast, cooking of soy did not increase the antioxidant activity, but led to an increment of isoflavone content in the methanolic extracts. Accordingly, through highperformance liquid chromatography (HPLC) characterization, we found that boiling and pressure cooking increased by 41 and 27% the phenolic content in cowpea, 17 and 13% in black bean, respectively. In soy, the only sample containing isoflavones, daidzein and particularly genistein content increased several folds. In cowpea, sprouting increased total phenolic, flavonoid and ortho-diphenol content and also the antioxidant activity. The HPLC analysis showed a 75% increase in flavonoids, mostly quercetin glucosides. To ascertain whether extracts of 5-day old cowpea sprouts could enhance the efficacy of 5-fluorouracil (5-FU), the most frequently used chemotherapeutic drug for colorectal cancer treatment, KRAS (HCT116 and HCT15) and BRAF (RKO and HT29) mutated cell lines were used. Although a more significant decrease in cell viability and increase in apoptosis induced by the sprout extract was observed in KRAS mutated cells, it was in BRAF mutated cells that the combination treatment of 5-FU and sprout extract was more promising. In fact, the presence of the extract significantly increased the 5-FU cytotoxicity. This effect did not seem to be due to quercetin alone, but it most likely results from the complex combination of phenolic compounds in the extract. Globally, this study shows for the first time the effect of legume extracts on cell cycle arrest and associated pathways, further highlighting their anti-colorectal cancer potential. The novel combination treatment of cowpea sprout extract and 5-FU may provide an innovative colorectal cancer therapy that can be explored in animal models and, later, in preclinical studies. Cowpea sprout extract can thus be explored as an added value food product and/or ingredient for functional foods and nutraceuticals. In conclusion, if deeper explored, the results gathered in this work may be used to provide guidelines for dietary recommendations regarding the inclusion of legumes for cancer prevention as well as for boosting the efficiency of conventional cancer treatments.

Embora o consumo de leguminosas esteja associado a benefícios para a saúde, o consumo de feijão-frade bem como de enumeras variedades de Phaseolus vulgaris tem vindo a diminuir nos países Mediterrâneos. Este decréscimo é essencialmente devido à influência do estilo de vida ocidental, particularmente nos hábitos alimentares. Em contraste com a soja, cuja atividade tem sido reportada em vários estudos, pouco se sabe sobre os mecanismos de ação das leguminosas na saúde, particularmente no cancro colorretal. Esta tese visa, portanto, fornecer uma caracterização molecular dos efeitos anti-cancro colorretal de extratos de várias leguminosas, nomeadamente de Vigna unguiculata, Glycine max e de quatro variedades de Phaseolus vulgaris, cruas, processadas (cozidas e cozidas sob pressão) e com rebentos de feijão frade com 5 dias de germinação. A caracterização fenólica revelou que ambos os métodos de processamento (cozedura e cozedura sob pressão) aumentaram o teor total de fenólicos e a atividade antioxidante nos extratos metanólicos das quatro variedades de Phaseolus e feijão-frade, em comparação com os extratos de feijão cru. Em contraste, o processamento de soja não aumentou a atividade antioxidante, mas levou a um incremento do teor de isoflavona nos extratos metanólicos. Em concordância, através da caracterização por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), verificou-se que a cozedura sem e sob pressão aumentaram em 41 e 27% o conteúdo fenólico no feijão-frade, 17 e 13% no feijão preto, respetivamente. Na soja, a única amostra que apresentou isoflavonas, o conteúdo em daidzeína e particularmente em genisteína aumentou várias vezes. No feijão-frade, a germinação aumentou o teor total de fenólicos, flavonoides e orto-difenol e também a atividade antioxidante. A análise por HPLC mostrou um aumento de 75% nos flavonoides, principalmente quercetinas glicosiladas. Para perceber se os extratos de rebentos de feijão frade com 5 dias poderiam aumentar a eficiência do 5-fluouracilo (5-FU), o fármaco quimioterapêutico mais utilizado na terapia do cancro colorretal, foram utilizadas linhas celulares com mutações no KRAS (HCT116 e HCT15) e no BRAF (RKO and HT29). Apesar de o extrato induzir uma diminuição na viabilidade celular e um aumento da apoptose mais significativo nas células com mutação no KRAS, foi nas células com mutação no BRAF que o tratamento de combinação com o 5-FU e extratos de rebentos foi mais promissor. De facto, a presença do extrato aumentou significativamente a citotoxicidade do 5-FU. Este efeito não parece ser devido à quercetina apenas, mas resultaram provavelmente de uma combinação complexa de compostos fenólicos presente no extrato. Globalmente, este estudo demonstrou pela primeira vez o efeito de extratos enriquecidos em fenólicos de leguminosas na paragem do ciclo celular e nas vias de sinalização associadas, reforçando o seu potencial anti-cancro colorretal. O novo tratamento combinado de extratos de rebentos de feijão frade com 5-FU poderá constituir como uma terapia inovadora para o cancro colorretal que poderá ser explorado em modelos animais e, mais tarde, em estudos pre-clínicos. Os extratos de rebentos de feijão frade poderão assim ser explorados como um produto alimentar de valor acrescentado e/ou ingrediente para alimentos funcionais e nutracêuticos. Em conclusão, se melhor explorados, os resultados obtidos neste estudo poderão ser usados em guias para recomendação nutricional no que diz respeito à inclusão de leguminosas para a prevenção do cancro, bem como, para melhor a eficiências das terapias de cancro convencionais.