Utilize este identificador para referenciar este registo: https://hdl.handle.net/1822/6744

TítuloEstudos celulares e moleculares no fungo dimórfico patogénico Paracoccidioides brasiliensis
Outro(s) título(s)Cellular and molecular studies on the dimorphic pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis
Autor(es)Almeida, A. J.
Orientador(es)Rodrigues, Fernando José dos Santos
Leão, Cecília
Data4-Jun-2007
Resumo(s)Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis, is a multinuclear thermal dimorphic fungus that switches from the environmental mycelial/conidial non-pathogenic form to the pathogenic multiple budding yeast. The general aim of the research developed within this thesis was the development of molecular tools to elucidate unclear biological phenomena in P. brasiliensis and the study of its genome content, in particular the interaction between DNA replication, multinuclear segregation and multiple budding, and cellular differentiation. In order to fulfil these objectives, we initially developed a flow cytometric (FCM) technique for cell cycle profile analysis based on high resolution measurements of nuclear DNA. The direct application of this method to yeast cells of ten P. brasiliensis isolates, grown in a batch system, revealed a genome size ranging from 26.3±0.1 Mb (26.9±0.1 fg) to 35.5±0.2 Mb (36.3±0.2 fg) per uninucleated cell. This analysis together with the evaluation of the intra-individual variability of a highly polymorphic P. brasiliensis gene, GP43, and taking into account the previously described average karyotype-determined genome size, showed that all analysed isolates presented a haploid, or at least aneuploid, DNA content. Moreover, no association was detected between genome size/ploidy and the clinical-epidemiological features of the studied isolates. In addition, we show that exponentially growing cells in poor-defined or rich-complex nutritional environments present an increased percentage of daughter cells in accordance with its multiple budding. However, during the stationary growth-phase cell cycle progression in rich-complex medium was characterized by an accumulation of cells with higher DNA content or pseudohyphae-like structures, whereas in poor-defined medium arrested cells mainly displayed two DNA contents. Moreover, the anti-microtubule drug benomyl was shown to induce an accumulation of cells presenting high and varying DNA contents. Altogether, our data suggest that, depending on the growth conditions, P. brasiliensis possesses alternative cell division control mechanisms to manage multiple budding and its multinucleated nature. In an attempt to understand the molecular basis of P. brasiliensis multiple budding, we isolated PbCDC42, a Rho-like GTPase encoding gene, which restore growth of the CDC42 null mutant in S. cerevisiae. The expression of PbCDC42 in Saccharomyces cerevisiae leads to the formation of both abnormal and multiple budded cells, indicating a deregulation of the spatial control of cell division and suggesting that Pbcdc42p may play an important role in the regulation of P. brasiliensis multiple budding. In addition, we have developed a molecular toolbox for the dimorphic fungus P. brasiliensis, specifically an efficient transformation and a gene expression system. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT) revealed to be possible in this fungus where cellular recovery and air drying of A. tumefaciens: P. brasiliensis mixtures are crucial parameters for high efficiencies. Overall data indicate a transformation efficiency of 78±9 transformants/cocultivation (5±1 transformants/106 target cells). P. brasiliensis GFP-expressing isolates were obtained by the use of this methodology. Furthermore, we demonstrated single gene copy integration per genome and generation of homokaryon progeny, relevant for the future use in targeted mutagenesis and linking mutations to phenotypes. In summary, the knowledge resulting from the work developed shed light on P. brasiliensis cell cycle progression and interaction between multiple budding and nuclear replication/division. In addition, the molecular tools herein developed, as well as their future prospects, have opened hopeful perspectives for studies on P. brasiliensis biological processes.
Paracoccidioides brasiliensis, o agente etiológico da paracoccidioidomicose, é um fungo termodimórfico multinucleado que sofre uma complexa transformação morfológica, passando da fase micelar/conidial não patogénica (a temperaturas ambientais) para a levedura patogénica multigemulante (a temperaturas do hospedeiro). A investigação realizada no âmbito desta tese teve como principiais objectivos desenvolver ferramentas moleculares para elucidar processos biológicos ainda pouco esclarecidos e estudar o conteúdo genómico, a interacção entre a replicação de DNA, a segregação multinuclear e a gemulação múltipla, e a diferenciação celular em P. brasiliensis. Nesse sentido, optimizámos um protocolo de citometria de fluxo baseado no conteúdo de DNA nuclear para a análise do perfil de ciclo celular de células leveduriformes. A aplicação directa desta metodologia a células leveduriformes de P. brasiliensis permitiu determinar o conteúdo em DNA de dez isolados distintos, variando entre 26,3±0,1 Mb (26,9±0,1 fg) e 35,5±0,2 Mb (36,3±0,2 fg) por célula leveduriforme uninucleada. A ploidia de vários isolados de P. brasiliensis foi também determinada através da comparação do tamanho do genoma, avaliado por citometria de fluxo, com a variabilidade intra-individual do gene altamente polimórfico GP43 de P. brasiliensis. Os nossos resultados indicaram que todos os isolados estudados possuem um conteúdo em DNA haploide, ou pelo menos aneuploide, não tendo sido encontrada nenhuma associação entre o tamanho do genoma/ploidia e as características clínicas ou ambientais dos isolados. Através da análise do perfil de ciclo celular de células leveduriformes de P. brasiliensis verificámos que células na fase exponencial de crescimento em meios pobre-definido e ricocomplexo apresentam uma elevada percentagem de células filhas em concordância com a multigemulação do fungo. No entanto, durante a fase estacionária de crescimento a progressão do ciclo celular em meio rico-complexo é caracterizada pela acumulação de células com conteúdos em DNA mais elevados ou estruturas do tipo pseudohifa, contrariamente ao que ocorre em meio pobre-definido em que as células apresentam maioritariamente dois conteúdos em DNA distintos. Por outro lado, foi demonstrado que o fungicida benomil induz uma paragem de progressão do ciclo celular caracterizada pela acumulação de células com um conteúdo em DNA elevado e variável. No seu conjunto, estes resultados sugerem que, dependendo das condições de crescimento, P. brasiliensis poderá apresentar mecanismos de controlo alternativos durante o crescimento celular de modo a regular a gemulação múltipla e a sua natureza multinuclear. Com o objectivo de elucidar a base molecular que regula a gemulação múltipla de P. brasiliensis, isolámos o gene PbCDC42, que codifica uma Rho GTPase, e demonstrámos que complementa funcionalmente a delecção total de CDC42 em Saccharomyces cerevisiae. A expressão de PbCDC42 em S. cerevisiae resulta tanto na formação de células anormais como de células multigemulantes, indicando que parece ocorrer uma desregulação do controlo espacial da divisão celular e sugerindo que Pbcdc42p poderá desempenhar um papel importante na regulação da gemulação múltipla de P. brasiliensis. Adicionalmente, desenvolvemos um conjunto de ferramentas moleculares para o estudo de células leveduriformes de P. brasiliensis, especificamente um sistema eficiente de transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (TMAT) e um sistema de expressão genética. Os nossos dados revelaram que a recuperação celular e a secagem das misturas de co-cultivo de Agrobacterium: P. brasiliensis são essenciais para a TMAT, resultando numa eficiência de transformação de 78±9 transformantes/co-cultivo (5±1 transformantes/106 células alvo). Foram, também, construídos isolados de P. brasiliensis que expressam GFP através da inserção do gene GFP sob o controlo de distintos promotores de vários fungos. Demonstrámos, ainda, que ocorre a integração de apenas uma cópia do gene em estudo aquando da TMAT, um facto relevante para o uso desta metodologia na mutagénese direccionada e na associação de mutações específicas ao fenótipo que induzem. Em suma, o conhecimento proveniente da execução destes trabalhos representa um passo importante na elucidação da progressão do ciclo celular da fase leveduriforme de P. brasiliensis e da interacção entre a gemulação múltipla e replicação/divisão nuclear. As ferramentas moleculares aqui desenvolvidas, assim como as suas perspectivas futuras, serão relevantes para o esclarecimento de processos biológicos em P. brasiliensis, bem como para a criação de novas linhas de investigação.
TipoTese de doutoramento
DescriçãoTese de doutoramento em Ciências da Saúde – Ciências Biológicas e Biomédicas.
URIhttps://hdl.handle.net/1822/6744
AcessoAcesso aberto
Aparece nas coleções:BUM - Teses de Doutoramento

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