Development of a fast and reliable phage-based method for Paenibacillus larvae detection

Abstract

American Foulbrood (AFB) is one of the most important bacterial hive diseases worldwide, affecting honeybee larva. It is caused by the Gram-positive and spore-forming bacterium Paenibacillus larvae. Spores are the infectious form of this disease, and its spread in a bee colony often leads to its complete destruction. When the clinical symptoms of AFB appear, the disease can only be controlled by burning the hive. The early detection of P. larvae spores will enable the implementation of prophylactic sanitary measures; however, traditional methods are time consuming and often impairs prophylaxis. So far, no effective techniques for spore fast and on site detection were developed. We propose herein a novel method for P. larvae spore detection using PlyPl23 CBD. For that, in this work, magnetic beads functionalized with KP-Crystallin (KP-Cryst) – a keratin-like binding protein - will be used to capture and concentrate spores. Nutrient-dependent germination will enable CBD binding and subsequent observation of green-decorated spores by Fluorescence Microscopy. We monitored spore losses throughout the process and observed that the use of functionalized beads allowed losses similar to those obtained with the currently available method to concentrate and purify spores. In average, 1.2-Log (CFU. mL-1) were lost from a 107 CFU.mL-1 suspension. A concentration of spores closer to what occurs in the field (105 CFU.mL-1 ) allowed an even lower loss: 0.4-Log (CFU.mL-1). Besides demonstrating KP-Cryst’s ability to bind to keratin-like proteins in the spore coat, it has been shown that PlyPl23 CBD was able to bind to germinating spores, allowing P. larvae detection. However, in the presence of homogenized bee mid-hind gut (simulation of real samples) spore capture and CBDdetection were hampered, and no green spores were visualised in the microscopic field from a suspension of 107 CFU.mL-1 after 4 h of germination. This was possible, yet, after 8 h of germination. This procedure brings an innovative strategy for P. larvae spore capture and subsequent detection in less than 24 h. The use of beads can replace previously used centrifugations steps, showing a high potential for the development of a fast detection KIT for on-site application. However, additional optimizations are required to increase the sensitivity of the method in real samples.

A loque americana (IA) é das mais importantes doenças bacterianas de colmeia a nível mundial, afetando a larva das abelhas. É causada pela bactéria Gram-positiva e formadora de esporos, a Paenibacillus larvae. Os esporos são a sua forma infeciosa, onde a sua propagação numa colónia de abelhas leva normalmente à sua total destruição. Quando os sintomas clínicos de IA aparecem, a doença só é controlada através da queima da colmeia. A deteção precoce de P. larvae permitirá a implementação de medidas profiláticas sanitárias; mas, os métodos tradicionais são morosos e prejudicam a profilaxia. Até à data, ainda não foram desenvolvidas técnicas eficazes para a sua deteção rápida e no local. Neste estudo propomos um novo método para a deteção de esporos de P. larvae usando PlyPl23 CBD. Para tal, serão utilizadas beads magnéticas funcionalizadas com KP-Cristalina - proteína de ligação tipo queratina - para capturar e concentrar esporos. A germinação dependente de nutrientes permitirá a ligação do CBD e, subsequente observação de esporos verdes através de Microscopia de Fluorescência. A perda de esporos foi monitorizada ao longo do processo, observando-se que o uso de beads funcionalizadas permitiu perdas idênticas comparativamente ao método atualmente disponível para concentrar e purificar os esporos. Em média, 1.2-Log (CFU.mL-1) foram perdidos de uma suspensão 107 CFU.mL-1. Uma concentração de esporos mais próxima da que ocorre nas abelhas (105 CFU.mL-1) permitiu uma redução ainda maior: 0.4-Log (CFU.mL-1). Além de demonstrar a capacidade da KP-Cryst se ligar a proteínas semelhantes à queratina na capa do esporo, foi demonstrada a capacidade de ligação do PlyPl23 CBD a esporos germinativos, permitindo a deteção de P. larvae. No entanto, na presença de intestino médio de abelha homogeneizado (simulação de amostras reais) a captura de esporos e a deteção por CBD foram prejudicadas, e nenhum esporo verde foi visualizado no campo partindo de uma suspensão de 107 CFU.mL-1 após 4 h de germinação. Ainda assim, tal foi possível com 8 h de germinação. Este procedimento representa uma estratégia inovadora para a captura e deteção de esporos de P. larvae no prazo de um dia útil. O uso de beads pode substituir etapas de centrifugação, mostrando um elevado potencial para o desenvolvimento de um KIT de deteção rápida para aplicação no local. Contudo, são necessárias otimizações adicionais para aumentar a sensibilidade do método em amostras reais.