Use of natural yeast isolates to produce succinic acid: biotechnological exploitation of Torulaspora delbrueckii

Abstract

Succinic acid (SA) is a platform chemical currently produced by chemical conversion of maleic anhydride through petrochemical processes. This acid plays an important role as a precursor for the synthesis of biodegradable polyesters, resins, dyestuff, pharmaceuticals, as food industry additive and many more. However, petrochemical process entails high costs and several environment problems, therefore other alternatives need to be found to produce SA. In recent years, the use of yeasts for SA production has become one of the main challenges of researchers. The main aim of this work was the evaluation of isolates of Torulaspora delbrueckii for SA production. In addition, we tested the capacity of this yeast to grow having SA as carbon source in order to understand if has membrane transporters for this acid. Initially, a screening comprising ten yeast species was performed to identify the best species for SA production. The two isolates with the highest production were T. delbrueckii strains, which is in agreement with several studies stating T. delbrueckii as a promising yeast for succinate production. Further on, once the goal is to produce SA at industrial level it was necessary to find a way to obtain high yields. In order to achieve that, nine T. delbrueckii strains were tested in different experimental conditions, to optimize the concentration of SA produced. The higher value obtained was 1.5 g/L of SA. Although this value is low, it is already considered as promiser since it was obtained using natural isolates. With the objective of trying to increase SA yields, T. delbrueckii strain (T12) was subjected to conditions of stress, in particular by the presence of high ethanol concentrations. The selected yeast when exposed to ethanol, failed to produce SA concluding that the presence of ethanol in the medium leads to a stressful condition that halts the production of SA by the yeast, however when transferring cells adapted to ethanol to a medium without ethanol there is an increase in the concentration of succinate. Afterwards, four T. delbrueckii strains were tested considering growth in a solid and aqueous media containing SA as sole carbon source, in order to understand if this yeast could grow well in the presence of this acid, which could be an indication of some transport system that could lead the acid inside the cell. Results showed that one T. delbrueckii strain was able to efficiently use SA as carbon source, with considerable growth, indicating that a transport system could be present. However, its presence must be strain dependent because only one of the four tested strains was able to grow similarly to the positive control. This is the first study showing that T. delbrueckii cells could display transporters for the uptake of SA, and further work is mandatory to confirm and identify which kind of transporters are present.

O ácido succínico (AS) é um químico de plataforma, atualmente produzido pela conversão química do anidrido maleico através de processos petroquímicos. Este ácido tem um importante papel como precursor para a síntese de poliésteres biodegradáveis, resinas, corantes, fármacos, como aditivo na indústria alimentar e muito mais. No entanto, o processo petroquímico implica altos custos e vários problemas ambientais, por isso outras alternativas precisam de ser encontradas para produzir AS. Nos últimos anos, o uso de leveduras para a produção do AS começou a ser um dos maiores desafios para os investigadores. O principal objetivo deste trabalho é avaliar a produção de AS por isolados de Torulaspora delbrueckii. Adicionalmente, testamos também a capacidade desta levedura crescer tendo como fonte de carbono o AS de forma a determinar se tem transportadores de membrana para esse ácido. Inicialmente, dez espécies de leveduras foram exploradas para identificar a melhor espécie produtora de AS. Os dois isolados com maior produção foram estripes de T. delbrueckii, o que se encontra em concordância com vários estudos que afirmam que T. delbrueckii é promissora para a produção de AS. Seguidamente, uma vez que o objetivo é produzir AS a nível industrial é necessário arranjar uma maneira de obter altos rendimentos. A fim de alcançar isto, nove estirpes de T. delbrueckii foram testadas em diferentes condições experimentais, para otimizar a concentração de AS produzido. O valor mais alto obtido foi de 1,5 g/L. Apesar deste valor ser baixo, já é considerado promissor sendo que foi obtido usando isolados naturais. De seguida, com o objetivo de tentar aumentar a produção de AS, uma estirpe de T. delbrueckii (T12) foi submetida a condições de stresse, em particular à presença de altas concentrações de etanol. A levedura selecionada quando exposta a etanol não produziu AS, concluindo que a presença de etanol no meio leva a uma condição de stresse que interrompe a produção de AS pela levedura, no entanto quando se transfere as células adaptadas a etanol para um meio sem etanol há um aumento na concentração do succinato. Mais tarde, quatro estirpes de T. delbrueckii foram testadas considerando o crescimento num meio sólido e líquido com AS como fonte de carbono, de modo a perceber se esta levedura consegue crescer bem na presença deste ácido, o que pode indicar que possuía um sistema de transporte capaz de transportar o ácido para dentro da célula. Os resultados mostram que uma estirpe T. delbrueckii foi capaz de utilizar o AS como fonte de carbono, com um crescimento considerável, indicando que o sistema de transporte pode estar presente. No entanto, a sua presença deve ser dependente da estirpe porque apenas uma estirpe das quatro testadas é que foi capaz de crescer de modo semelhante ao controlo positivo. Este é o primeiro estudo que mostra que as células de T. delbrueckii podem apresentar transportadores para o AS e trabalhos posteriores serão necessários para confirmar e identificar que tipo de transportadores poderão estar presentes.