Chitosan/Poly(ε-caprolactone) blend scaffolds for cartilage repair

Abstract

Tissue engineering (TE) is an evolving field with a great potential on providing permanent solutions for tissue damage or tissue loss problems. Its principles rely on the combination of cells, scaffolds and "helping factors" (like biomolecules), in order to reconstitute the damaged or lost tissue. Cartilage tissue is no exception to this approach and, additionally, it is one of the ideal candidates for TE, as it differs from other tissues on its limited capacity of self-repair. Regenerating defects that result from traumatic injury or degenerative joint diseases, i.e. articular cartilage (AC) (hyaline) problems, have a major impact on patients. The scaffold biomaterial is determinant for its TE application success. Blending naturally derived and synthetic polymers has been applied in TE in order to combine specific properties of each one of these polymer categories. The scaffold architecture is also another important parameter and a three-dimensional (3D) well interconnected porous structure plays an important role on the chondrogenic activity maintenance. In this context, fiber-based scaffolds are particularly interesting as they can provide large surface areas, highly interconnected structures and a variety of geometries. The work presented at this thesis aimed to study the potential of chitosan (CHT)/poly(ε-caprolactone) (PCL) blend 3D fiber-mesh scaffolds as support structures for AC tissue repair. A new common solvent solution of 100 vol.% of formic acid was used to prepare three different polymeric solutions – 100, 75 and 50CHT (numbers represent CHT weight percentage) – that were wet-spun in order to obtain microfibers. Scanning electron microscopy (SEM) analysis showed a homogenous surface distribution of PCL. A good dispersion of PCL within the CHT phase was achieved as analyzed by differential scanning calorimetry (DSC) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The fibers were folded into cylindrical moulds and underwent a thermal treatment to obtain the scaffolds. The μCT analysis revealed an adequate porosity, pore size and interconnectivity of the scaffolds for TE applications. The PCL content increase in the blends diminished their swelling ratio and increased fiber surface roughness. Biological assays were performed after culturing bovine articular chondrocytes up to 21 days. SEM analysis, live-dead and metabolic activity assays showed that cells attached, proliferated, and were metabolically active over all scaffolds formulations. Differentiation studies showed cartilaginous ECM formation in all fiber-mesh formulations. The 75CHT scaffolds supported the most cartilage regeneration, as between the 14th and 21st days of culture DNA amount was similar but GAG production increased, being also the highest amount among all formulations. ECM overall distribution over the 75CHT and 50CHT 3D structures was homogeneous. CHT acellular scaffolds compressive mechanical properties were enhanced with the addition of PCL. The better mechanical performance was presented by the 50CHT formulation, whereas the 75CHT scaffolds presented the best biological response. As ECM formation is expected to increase structures mechanical properties, the 75CHT scaffold is potentially very promising for AC TE applications.

A engenharia de tecidos (ET) é uma área em constante evolução e que se baseia na combinação de células, estruturas de suporte (scaffolds) e factores co-adjuvantes, como biomoléculas, no intuito de regenerar/reconstituir tecidos nativos danificados ou perdidos. A cartilagem não é excepção a esta abordagem e, adicionalmente, é considerada como uma "candidata ideal" pois difere dos outros tecidos devido à sua limitada capacidade de auto-reparação. Para além disso, regenerar defeitos resultantes de traumas ou doenças degenerativas das articulações, isto é, da cartilagem articular (CA), é, hoje em dia, de elevada importância. O material do qual o scaffold é feito é um dos factores determinantes para o seu sucesso e a mistura de polímeros de origem natural com polímeros sintéticos tem sido uma estratégia muito utilizada em ET, combinando propriedades vantajosas específicas de cada uma das classes de materiais. A arquitectura do scaffold é também um parâmetro importante dado que uma estrutura tridimensional (3D) bem inter-conectada e porosa é determinante para a manutenção da actividade condrogénica. Scaffolds constituídos por fibras propiciam elevadas áreas de superfície, estruturas bem interconectadas e a possibilidade de se poderem obter variadas geometrias. O trabalho apresentado nesta tese teve como objectivo o estudo do potencial de scaffolds de fibras obtidas a partir da mistura de quitosano (CHT) e poli(ε-caprolactona) (PCL), como estruturas de suporte para a regeneração de CA. Foi utilizada uma solução de 100 %vol. de ácido fórmico como solvente comum para preparar três soluções poliméricas diferentes – 100CHT, 75CHT e 50CHT (os números representam a percentagem de CHT na mistura). Estas foram processadas por wet-spinning de modo a obter micro-fibras. A análise efectuada por microscopia electrónica de varrimento (SEM) revelou homogeneidade na distribuição superficial de PCL. Foi possível verificar uma boa distribuição dos domínios de PCL pela fase de CHT, através de calorimetria diferencial de varrimento (DSC) e espectroscopia de infravermelhos por transformada de Fourier (FTIR). Para se obterem os scaffolds, as fibras foram colocadas em moldes cilíndricos e sujeitas a tratamento térmico. A análise através de micro-tomografia computorizada e SEM revelou valores de porosidade, tamanho de poros e interconectividade dos scaffolds apropriados para aplicações de ET. O aumento de PCL nas misturas diminuiu a capacidade de retenção de água dos scaffolds e aumentou a rugosidade da superfície das fibras. Foram realizados ensaios biológicos com condrócitos articulares de origem bovina durante 21 dias. Através de SEM e ensaios de viabilidade celular e actividade metabólica, verificou-se que as células aderiram, proliferaram e estiveram metabolicamente activas durante o período de cultura. Estudos de diferenciação revelaram a produção de matriz extra-celular cartilagínea (ECM) em todas as três formulações. Os scaffolds de 75CHT revelaram suportar a melhor produção de ECM e a sua distribuição sobre as estruturas de 75CHT e 50CHT foi homogénea. As propriedades mecânicas do CHT foram melhoradas pela sua mistura com PCL, tendo os scaffolds de 50CHT revelado a melhor performance mecânica. Porém, como é espectável que a produção de ECM melhore as propriedades mecânicas de toda a estrutura e dado que a formulação de 75CHT suportou a melhor actividade condrogénica, esta revela-se bastante promissora para aplicações de ET para CA.