Understanding the role of the different fractions of human umbilical cord perivascular cells’ secretome in spinal cord injury repair

Abstract

Lesões Vertebra-Medulares (LVMs) são uma condição clinica que geralmente causam paraplesia e tetraplesia. As suas consequencias devastadores estão relacionadas com elevadas respostas inflamatórias e com a formação de uma cicatriz glial, que inibem processos endógenos de regeneração axonal. Devido à sua complexidade, terapias eficazes ainda não foram implementadas na clinica. Neste sentido, as Células Estaminais Perivasculares do Cordão Umbilical Humano (CEPVCUH) foram recentemente sugeridas como uma potential terapia para as LVMs, uma vez que são capazes de promover, através do seu secretoma, o reparo endógeno da medula espinhal, bem como de controlar o seu processo inflamatório. Assim sendo, o objectivo da presente tese foi de estabelecer uma ligação entre o secretoma, na forma de meio condicionado (CM) das CEPVCUHs, e das fracções destas, com possiveis aplicações para o reparo de LVMs. Primeiramente, avaliamos o potencial neurogenico do CEPVUH-CM e as fracção maior (F>5kDa) e menor do que 5kDa (F<5kDa), in vitro, usando Células Neuro-Progenitoras (CNPs). O crescimento de neurites promovido pelo secretoma de CEPVUHs, e as suas fracções, foi igualmente averiguado usando um modelo in vitro de explantes de Ganglios das Raízes Dorsais (GRDs). No sentido de avaliar o potencial terapêutico da nossa estratégia, o secretoma de CEPVUHs e as suas fracções foram igualmente testado in vivo, usando um modelo animal de LVM. Os animais em questão foram sujeitos a uma contusão na medula espinhal e subsequentemente divididos em grupos com diferentes tipos de tratamento: salino, CEPVUH-CM, CEPVUH-F>5kDa e CEPVUH-F<5kDa. Por ultimo, foram caracterizadas, por espectrometria de massa, as molecules secretadas pelas CEPVUH. Os nossos resultados sugerem que tanto o meio completo (CM) como a F>5kDa têm potential neurogénico superior que a F<5kDa. No que toca às experiências com GRDs, a fracção maior mostrou ter potencial neuritogénico superior às outras condições, quer na presença ou ausencia do Factor de Crescimento Nervoso (FCN). Para além disso, as experiências in vivo mostraram que apesar de tanto a F>5kDa, como a F<5kDa serem capazes de induzir uma redução no volume de tecido lesionado em termos histológicos, só a F<5kDa foi capaz de promover recuperação em termos funcionais, medida pelo teste do BBB. Por ultimo, a análise de proteómica revelou que a F>5kDa tem na sua constituição moleculas capazes de induzir o crescimento de neurites, de promover neuroprotecção e neuro-diferentiação; tais resultados explicam os resultados da mesma, quer in vitro, quer in vivo. No geral, os resultados apresentados nesta tese indicam que as CEPVUHs têm potencial para o desenvolvimento de futuras ténicas para tratar LVMs, e que as fracções do secretoma destas células demonstram um potential distinto em termos de neurogénese, neuritogénese e neuroprotecção.

Spinal Cord Injury (SCI) is a major clinical problem that commonly causes paraplegia and tetraplegia. Its devastating consequences are related to high inflammatory responses and the formation of a glial scar, which is highly inhibitory towards axonal regeneration. Due to such complexity, effective therapies are yet to be implemented. Recently, the use of Human Umbilical Cord Perivascular Cells (hUCPVCs) has been suggested as a potential therapy for SCI, as they promote spinal cord’s endogenous repair and control inflammation through their secretome. In the present thesis, we aimed to establish a link between hUCPVCs’ conditioned media (CM) composition, and the different fractions within it, with possible applications towards spinal cord’s repair. Firstly, we evaluated the neurogenic potential of hUCPVCs-CM, and its fractions above and bellow 5kDa (F>5kDa and F<5kDa), in vitro, using Neural Progenitor Cells. Neurite outgrowth promoted by hUCPVCs secretome, and its fractions, was also evaluated using an in vitro model of axonal growth based on Dorsal Root Ganglia (DRG) explants. In order to evaluate the therapeutic potential of our strategy, hUCPVC-CM and its fractions were also tested in vivo using a SCI animal model. Rats were subjected to a contusion injury, and divided into groups with four different types of treatment: Saline, hUCPVC-CM, hUCPVC-F>5kDa and hUCPVC-F<5kDa. Lastly, we aimed to characterize and identify hUCPVCsecreted molecules by mass spectrometry. Our resuls suggest that both the complete CM and the F>5kDa hold higher neurogenic potential than the F<5kDa. Regarding the DRG experiments, the F>5kDa showed higher neuritogenic potential than the other conditions either in the presence or absence of Nerve Growth Factor (NGF). Additionally, our in vivo experiments showed that although both the F>5kDa and F<5kDa induced lesion sparing on the histological level, only the F<5kDa promoted functional recovery when compared to the other conditions, measured by the BBB test. Finally, proteomic analysis revealed that the F>5kDa holds molecules capable of inducing neurite outgrowth, neuroprotection and neuronal differentiation, which explain its results in vitro and in vivo. Altogether, the results presented in this thesis indicate that hUCPVC-CM holds potential for the development of future therapeutic techniques, and that its fractions display different therapeutic potentials in neurogenesis, neuritogenesis and neuroprotection.