Utilize este identificador para referenciar este registo: https://hdl.handle.net/1822/75176

TítuloEsterification of drugs: a tool to improve hydrophobicity and encapsulation efficiency
Outro(s) título(s)Esterificação de drogas: uma ferramenta para aumentar a hidrofobicidade e eficiência de encapsulação
Autor(es)Noro, Jennifer Martins
Orientador(es)Cavaco-Paulo, Artur
Silva, C.
Palavras-chaveEnzimas
Esterificação
Metotrexato
Modificação química
Nanoemulsões
Chemical modification
Enzymes
Esterification
Methotrexate
Nanoemulsions
Data29-Abr-2021
Resumo(s)A necessidade de implementação de processos mais verdes e amigos do ambiente, continua a ser uma temática de grande importância para a comunidade científica. Das diferentes estratégias disponíveis para modificar e estabilizar compostos hidrofóbicos, o uso de enzimas para sua síntese e de nanoemulsões para o seu encapsulamento, são as abordagens mais comuns. Nesta tese, foram desenvolvidas nanoemulsões compostas por oligossacarídeos lipofílicos para a encapsulação de um composto hidrofóbico, o metotrexato (MTX). Enzimas, nomeadamente lipases ou proteases, foram aplicadas como catalisadores para a biossíntese de compostos hidrofóbicos com o objetivo de desenvolver alternativas ecológicas para futuras aplicações industriais. Primeiramente, a síntese de ciclo-oligossacarídeos lipofílicos (β-ciclodextrina, γ-ciclodextrina e ciclosoforaose) foi realizada através da ligação de cadeias de palmitoílo aos grupos hidroxilo. As estruturas hidrofóbicas desenvolvidas revelaram propriedades emulsificantes quando submetidas a ultrassons. A sua estabilidade, baixo tamanho e baixa polidispersividade demonstraram o alto potencial destas emulsões como novos dispositivos para o encapsulamento e libertação do MTX. Posteriormente, foram usadas duas abordagens enzimáticas para produzir pró-drogas de MTX. Inicialmente, lipases da Thermomyces lanuginosus (TL) e da Cândida antarctica B (CALB) foram utilizadas como catalisadores para a reação do MTX com triacilgliceróis e ciclodextrinas. Um meio aquoso, sob a ação de ultrassons, revelou ser uma estratégia eficaz para a síntese de pró-drogas de MTX, com o acoplamento de compostos não tóxicos. Na segunda abordagem, foi utilizada a α-quimiotripsina do pâncreas de bovino para a auto-polimerização do MTX. A protease revelou capacidade de produzir oligómeros de MTX até um máximo de 6 unidades. Foi assim estabelecida uma nova via para a produção de uma pró-droga de MTX polimérico, salientando o potencial desta protease para a catálise de substratos não naturais. Ao longo desta tese, foi também avaliado o efeito da modificação química de enzimas nas suas propriedades catalíticas. Numa primeira abordagem, as modificações foram realizadas através da PEGilação das lipases TL, CALB e de uma cutinase da fusarium solani pisi. Verificou-se que enquanto a PEGilação melhorou a atividade hidrolítica da CALB e da cutinase, a atividade da lipase TL permaneceu inalterada. O efeito dessa modificação foi também avaliado na atividade de polimerase das enzimas, na síntese de um poliéster, o poli(etileno glutarato). Das três enzimas estudadas, a lipase TL PEGuilada foi responsável pela maior produção de polímero, juntamente com um maior grau de polimerização (DP), em comparação com a forma nativa da enzima. Ambas as formas da CALB exibiram atividade de polimerase semelhante. O efeito da PEGuilação na cutinase não foi significativo, sendo detetado um pequeno aumento na conversão do polímero, em comparação com a enzima nativa, porém com menor DP. A segunda abordagem, implementada para a melhoria das propriedades catalíticas das lipases, baseou-se na ligação de pequenos ligandos hidrofóbicos, aldeídos e isotiocianatos, à lipase TL. O efeito dos ligandos na atividade hidrolítica e na estabilidade da enzima foi extensivamente estudado, tendo os dados revelado maior estabilidade a diferentes temperaturas e pHs, após a sua modificação. Além disso, a lipase modificada com 4 cadeias de dodecil (a partir do dodecil aldeído) apresentou excelente atividade catalítica, avaliada por reação com substratos de diferentes tamanhos de cadeia alifática (p-nitrofenil acetato a p-nitrofenil palmitato). Posteriormente, foi avaliada a atividade das enzimas na transesterificação do p-nitrofenil palmitato e na esterificação do ácido oleico, usando como substratos álcoois com diferentes tamanhos de cadeia (de metanol a eicosanol). A lipase modificada com 4 cadeias de dodecil, apresentou uma atividade superior, para ambas as reações, em comparação com a lipase nativa. Este incremento foi diretamente proporcional ao tamanho do álcool utilizado como substrato. Estas estratégias demonstraram a grande potencialidade das enzimas modificadas na biossíntese de produtos industriais de alto valor acrescentado.
The pursuit for green and environmentally friendly processes is still a great challenge among the scientific community. From the different strategies available to modify and stabilize hydrophobic compounds, the use of enzymes for their synthesis and of nanoemulsions for their encapsulation, are the most common approaches. In this thesis, nanoemulsions composed by lipophilic oligosaccharides were developed for the encapsulation of an hydrophobic compound, methotrexate (MTX). Enzymes, namely lipases or proteases, were applied as catalysts for the biosynthesis of hydrophobic compounds aiming to develop new eco-friendly routes for future industrial applications. Firstly, the synthesis of lipophilic cyclo-oligosaccharides (β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin and cyclosophoraose) was carried out through the chemical coupling of palmitoyl chains to the hydroxylic groups. The hydrophobic structures showed emulsifying properties under ultrasonic energy. Their stability, narrow size, and low polydispersity demonstrated the high potential as new nanodevices for encapsulation and delivery of MTX. Afterward, two different enzymatic approaches were used to produce MTX-prodrugs. In a first approach, lipases from Thermomyces lanuginosus (TL) and from Candida antarctica B (CALB) were applied as catalysts for the reaction of MTX with triacylglycerols and cyclodextrins. Aqueous medium, together with ultrasounds showed to be a successful route for the synthesis of MTX ester prodrugs, with the coupling of non-toxic compounds. The second approach included the use α-chymotrypsin from bovine pancreas for the self-polymerization of MTX. The protease revealed the ability to produce oligomers up to 6 MTX units. A novel pathway to produce a polymeric MTX prodrug was established, unravelling the potential of this protease for the catalysis of non-natural substrates. Along this thesis, the effect of the chemical modification of enzymes on their catalytic properties was also assessed. In a first approach, the chemical modifications were performed throughout PEGylation of lipase TL, CALB and cutinase from fusarium solani pisi. The data revealed that whereas PEGylation improved the hydrolytic activity of CALB and cutinase, it did not alter the activity of lipase TL. The effect of this modification was also evaluated throughout their polymerase activity in the synthesis of a polyester, poly(ethylene glutarate). From the three enzymes, PEGylated lipase TL was responsible for the highest polymer production with the highest degree of polymerization (DP), in comparison to the native form. Both CALB forms displayed similar polymerase activity. The effect of PEGylation on cutinase was not significant being detected a small increase of polymer conversion, however with lower DP, comparing with the native enzyme. The second approach for the improvement of lipases’ catalytic properties covered the grafting of small hydrophobic aldehydes and isothiocyanates to the lipase TL. The effect of the linkers was extensively studied in terms of hydrolytic activity and stability, and the data obtained revealed higher temperature and pH stability after modification. Moreover, the lipase grafted with 4 dodecyl chains (from dodecyl aldehyde) showed outstanding catalytic activity, evaluated against a panoply of substrates differing in the aliphatic chain size (p-nitrophenyl acetate to p-nitrophenyl palmitate). Afterward, the enzymes’ activity in the transesterification of p-nitrophenyl palmitate, and in the esterification of oleic acid was evaluated. Chain size differentiated alcohols (methanol to eicosanol) were tested as substrates of the reactions. The modified lipase (with 4 dodecyl chains) showed superior activity for both reactions comparing to the native lipase. This increment was more directly proportional to the size of the alcohol used for the reaction. These strategies revealed high potentiality for the use of modified enzymes on the biosynthesis of industrial added-value products.
TipoTese de doutoramento
DescriçãoTese de Doutoramento em Engenharia Química e Biológica
URIhttps://hdl.handle.net/1822/75176
AcessoAcesso aberto
Aparece nas coleções:BUM - Teses de Doutoramento
CEB - Teses de Doutoramento / PhD Theses

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