Engineering the tendon-to-bone tissue interface mimicking its microenvironment: from stem cells to gradient scaffolds

Abstract

Within the human body, musculoskeletal tissues interfaces, such as the tendon-to-bone, are characterized by a unique compositional and structural gradient between dissimilar tissues. Interface injuries are very challenging to treat, and clinical outcomes using currently available therapies are unsatisfactory, mostly leading to the formation of a fibrotic tissue. To overcome this, interface tissue engineering has evolved over the past years taking advantage from major advances in biomaterial design to precisely control biophysical cues coupled with bioactive molecules for efficient regulation of cells towards the formation of a functional tissue. In this thesis, different strategies were explored for a better understanding of the basic molecular events occurring in tendon-to-bone interface while developing biomimetic templates to govern cellular responses, aiming at developing mimetic in vitro models and efficient regenerative strategies to treat tendon-to-bone interface injuries. In the first study of this thesis (Chapter 5), direct co-cultures of human tendon-derived stem cells and pre differentiated human adipose-derived stem cells towards the osteogenic lineage were established to determine optimal culture conditions to maintain both phenotypes and understand the effect of direct contact in the expression of interface markers. In the subsequent work (Chapter 6), the microenvironment oxygen tension (hypoxia vs normoxia) was modulated to study and control cells phenotype. The concept of gradient scaffolds was then explored (Chapter 7) to create a continuous fibrous structure composed of mechanically robust microfibers with topographical cues to stimulate the differentiation of hASCs towards enthesis specific lineages. In Chapter 8, topographically different fibers were biofunctionalized with platelet lysates and assembled into continuous 3D functionally graded scaffolds to replicate the tendon to-bone microstructure while providing the cues for hASCs multi-differentiation in a single construct. Finally (Chapter 9), in vitro physiological and pathological bioengineered models of tendon were investigated through the use of hierarchically assembled yarns coated with a hydrogel coating of platelet lysates. Overall, the work developed under this thesis allowed the understanding of the effect of medium conditions and oxygen tension on the modulation of cell’s phenotype along with the importance of cell cell contact on the regulation of tendon-to-bone biomarkers. Additionally, fabricated scaffolds supported the native behavior of tendon-to-bone cells in artificial 3D constructs. These systems are expected to boost tissue in vitro modulation, surgical host integration and further tissue regeneration.

No corpo humano, as interfaces dos tecidos músculo-esqueléticos, como o tendão-osso, são caracterizadas por um gradiente de composição e estrutura entre diferentes tecidos. Lesões na interface são difíceis de tratar e os resultados clínicos, usando as terapias atualmente disponíveis, são insatisfatórios, principalmente devido à formação de tecido fibrótico. Para ultrapassar isso, a engenharia de tecidos de interface evoluiu nos últimos anos, aproveitando os principais avanços no design de biomateriais para controlar com precisão os fatores biofísicos conjuntamente com moléculas bioativas para a regulação das células e formação de um tecido funcional. Nesta tese, diferentes estratégias foram exploradas de forma a compreender vias moleculares que ocorrem na interface tendão-osso, através do desenvolvimento de modelos biomiméticos in vitro e estratégias regenerativas para tratar lesões na interface tendão-osso. No primeiro estudo desta tese (Capítulo 5), co-culturas diretas de células estaminais derivadas do tendão e células estaminais derivadas do tecido adiposo, pré-diferenciadas na linhagem osteogênica, foram estabelecidas para determinar as condições ideais de cultura de forma a manter ambos os fenótipos e compreender o efeito do contato direto na expressão dos marcadores de interface. Subsequentemente (Capítulo 6), a tensão de oxigênio no microambiente (hipóxia vs normóxia) foi modulada para estudar e controlar o fenótipo das células. O conceito de estruturas com gradientes foi então explorado (Capítulo 7). Estruturas fibrosas compostas de microfibras mecanicamente robustas diferentes topografias foram criadas para estimular a diferenciação de células estaminais nas linhagens específicas de interface. No Capítulo 8, fibras topograficamente diferentes foram funcionalizadas com lisado de plaquetas e criadas estruturas funcionais 3D contínuas para replicar a microestrutura do tendão-osso, fornecendo fatores necessários para a diferenciação de hASCs. Finalmente (Capítulo 9), modelos de saúde e doença de tendão in vitro foram investigados através do uso de fibras hierarquicamente montados e revestidas com um hidrogel de lisado de plaquetas. De maneira geral, o trabalho desenvolvido nesta tese permitiu a compreensão do efeito das condições do meio e da tensão de oxigênio na modulação do fenótipo celular, juntamente com a importância do contato célula-célula na regulação de biomarcadores do tendão-osso. Além disso, as estruturas 3D fabricadas induziram a expressão de marcadores tendão-osso. Espera-se que esses sistemas aumentem a modulação in vitro do tecido, a integração cirúrgica e a regeneração do tecido.