Identification and functional characterization of novel plasma membrane carboxylate transporters

Abstract

Organic acids are recognized as versatile chemical compounds with a vast variety of applications in sectors ranging from food and beverages, pharmaceutical, personal care, cosmetic products, consumer goods to the chemical industry. Due to the strong demand for these compounds, alternative approaches to non-sustainable processes, e.g. chemical synthesis from petroleum derivatives, are being developed. Sustainable strategies rely on the utilization of microbial cell factories, where transporter proteins play a crucial role through the control of substrate influx and product efflux. In particular, the expression of suitable carboxylic acid exporters avoids the internal cell toxicity due to the accumulation of these compounds, while facilitating its purification from the culture broth. The biodiversity of the microbial world is an excellent pool to uncover new organic acid transporters. In this study, wild yeast species isolated from acidic environments were explored regarding their ability to utilize organic acids. The yeast Cyberlindnera jadinii was selected for further studies due to its ability to utilize a vast range of organic acids as sole carbon and energy source, to synthesize a variety of valuable compounds for the food and pharmaceutical sectors, its intrinsic robust characteristics, and its capacity to use inexpensive media with high productivity levels. Using an in silico approach, we have explored the predicted transportome of C. jadinii and selected putative carboxylate transporters for functional characterization by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. A total of 16 plasma membrane carboxylate transporters, members of the AceTr, SHS, SSS, TDT, DASS, and MCT families, were characterized in terms of transport activity and specificity, structural features, and evolutionary relationships. S. cerevisiae was also used as expression host to deepen the knowledge of the citrate exporter CexAp from Aspergillus niger, a member of the DHA1 transporter family. The structural characterization of AceTr family members Ato1 and SatP led to the identification of a conserved motif essential for protein function. In addition, the plasma membrane proteins Gpr1 from Yarrowia lipolytica and AceP from the archaea Methanosarcina acetivorans were functionally characterized as acetate transporters. The role of AceTr members from S. cerevisiae, Ato1, Ato2, and Ato3, in the transport of monocarboxylic acids was evaluated via a combination of directed evolution, whole-genome resequencing, and reverse engineering, leading to the discovery of Ato2 and Ato3 mutants as two novel lactic acid transport proteins. Structural insights were also provided using 3D structure predictions combined with molecular docking.

Os ácidos orgânicos são reconhecidos como compostos versáteis com uma vasta aplicabilidade em sectores desde a área alimentar à indústria química. A forte procura por estes compostos exige abordagens alternativas à sua produção convencional, como a síntese química a partir de derivados de petróleo. As estratégias sustentáveis incluem a utilização de fábricas celulares microbianas nas quais as proteínas transportadoras desempenham um papel crucial no controlo do importe de substratos e o exporte de produtos. O exporte de ácidos carboxílicos evita a sua toxicidade intracelular, facilitando a sua purificação do meio de cultura. A biodiversidade microbiana é um excelente reservatório para a descoberta de novos transportadores de ácidos orgânicos. Neste estudo, foram estudadas espécies de leveduras provenientes de ambientes ácidos e avaliada a sua capacidade de utilização de ácidos orgânicos. A levedura Cyberlindnera jadinii foi selecionada para estudos posteriores dada a sua capacidade de utilização de uma gama alargada de ácidos orgânicos como fonte única de carbono e energia, para além de sintetizar vários compostos relevantes para os setores industriais. Esta levedura apresenta ainda uma grande robustez e tem capacidade para crescer em meios de cultura baratos apresentando elevados níveis de produtividade. Numa abordagem in silico, explorámos o transportoma inferido de C. jadinii, selecionando vários potenciais transportadores de carboxilatos para uma caracterização funcional por expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae. Um total de 16 proteínas-alvo, membros das famílias AceTr, SHS, SSS, TDT, DASS e MCT, foram caracterizadas quanto à sua capacidade transporte de carboxilatos, especificidade, características estruturais e relações evolutivas. O exportador de citrato CexA de Aspergillus niger, membro da família DHA1, foi também caracterizado por expressão heteróloga na levedura S. cerevisiae. A caracterização estrutural dos membros da família AceTr, Ato1 e SatP, levou à identificação de um motivo conservado nestas proteínas transportadoras, essencial para a sua função. As proteínas Gpr1 da levedura Yarrowia lipolytica e AceP da archaea Methanosarcina acetivorans foram ainda caracterizadas como transportadores de acetato. O papel no transporte de ácidos carboxílicos de outros membros desta família, Ato1, Ato2 e Ato3 de S. cerevisiae, foi avaliado por uma abordagem combinada de evolução dirigida, ressequenciação do genoma e engenharia reversa, levando à descoberta dos mutantes Ato2 e Ato3 como dois novos transportadores de lactato. As características estruturais destas proteínas foram avaliadas por modelação de estruturas 3D e estudos de docking molecular.