Bacterial cellulose wound dressing

Abstract

Wounds, in particular traumatic (e.g. burns) and chronic ones, are a major cause of morbidity, impaired life quality and high health care costs. They often result in long hospitalization stays, taking up substantial health resources in developed countries. Conventional treatments are often painful, expensive and may increase the infection risk, compromising the treatments’ time and success. In recent years, there have been efforts to develop new advanced methodologies to heal chronic wounds, including the topic use of growth factors or cell-based therapies. However, in many cases, the therapeutic efficacy is low, the therapies are expensive and require application in a clinical facility. Therefore, development of new therapeutics is absolutely necessary and important to satisfy these unmet clinical needs. So, this work comprised the development of a safe, easy-to-use and non expensive novel dressing, aimed at efficiently addressing these issues, by attaining faster and proper wound healing. The use of bacterial nanocellulose (BNC) has already demonstrated positive results in the treatment of different kinds of wounds. Additionally, BNC is considered a promising drug delivery system. In this work, BNC was conceived as a protective barrier against exogenous agents (particles, microorganisms) that can impair wound healing, and as a drug carrier for the controlled release of hydrophobic drugs, namely of vitamin D3 (Vit D3 ), an inducer of the endogenous expression of antimicrobial peptide (AMP) LL37, known for accelerating the wound healing process. In a first part of this project, the optimization of the static BNC production was performed, aiming at making it viable and economic at large scale. First, an experimental design, based on response surface methodology (RSM) - central composite design (CCD) - was used to optimize the culture medium for BNC production by Komagataeibacter xylinus BPR 2001, using a simple culture medium composition based on byproducts from the food industry. The optimal conditions for BNC production were (% (m/v)): molasses 5.38; CSL 1.91; ammonium sulphate 0.63; disodium phosphate 0.270; citric acid 0.115 and ethanol 1.38 % (v/v). The experimental and predicted maximum BNC production yields were 7.5 ±0.54 g/L and 6.64 ±0.079 g/L, respectively, after 9 days at 30 ºC. Furthermore, the effect of the surface area and culture medium depth on the BNC production yield and productivity were evaluated. BNC dry mass production increased with the surface area and with the medium volume (depth) and fermentation time. Also, as long as nutrients were still available in the culture media, the BNC mass productivity was maintained overtime. The pre-inoculum preparation (PIP) step was also optimized with regards to the (a) identification of an inexpensive culture medium for pre-inoculum leading to a high cell density; (b) analysis of the effect of the initial cellular concentration on the static production of BNC and (c) kinetics of cell growth throughout the different steps of pre-inoculum preparation, including static and stirred - laboratorial and pilot-scale – fermentations. The best composition for PIP medium was (% (m/v)): Glucose and Fructose syrup 1.5- 2.0; Corn Step Liquor (protein basis) 0.7; citric acid 0.115; Na2HPO4 0.27. The analysis of the cell growth kinetics in the different steps of PIP showed that a careful control on the culture time in each stage is advisable. The time required to reach the exponential phase was very different in each stage of PIP, reducing significantly from the static culture to the stirred culture and for large scale stirred culture, in a 75 L Bioreactor. In a second part of this work, the use of BNC as a drug carrier was addressed. Since Vit D3 is poorly water soluble, and thus not easily incorporated in the highly hydrophilic environment of the BNC membrane, Vit D3 was encapsulated in a self-assembled hyaluronic acid (HA)-based amphiphilic nanogel and then incorporated in the BNC membrane. The carrier was obtained by grafting hexadecylamine (Hexa) into the HA backbone (HA-Hexa). Vit D3 was successfully loaded into the nanogel (HA-Vit D3 ) with an encapsulation efficiency between 60-91 %. The loaded system- HA-Vit D3 - was embedded into BNC, conceived as a transdermal delivery system. The release of Vit D3 was monitored over time using a Franz cell device. Around 70 % of the initial Vit D3 available was released from BNC membranes in the first 48 h. Most importantly, we observed that the released Vit D3 still remained within the HA-Hexa nanogel carrier. Vit D3 is known to stimulate the endogenous production of human cathelicidin (LL37), which is known to accelerate wound healing. Thus, formulations of HA-Vit D3 and HA-LLKKK18 (an analogue of LL37) were tested in vivo, using excision and chronic wound in dexamethasone treated C57BL/6 and db+/db+ mice models, as to evaluate and compare their efficiency in wound repairing. However, the results did not confirm any wound healing improvement.

As feridas crónicas e traumáticas (e.g. queimaduras) apresentam uma elevada morbilidade, afetando severamente a qualidade de vida dos pacientes. Os tratamentos convencionais implicam longos períodos de internação hospitalar, com significativo consumo de recursos dos sistemas de saúde nos países desenvolvidos. Além disso, são dolorosos, caros e podem aumentar o risco de infeção, comprometendo a duração e o sucesso dos tratamentos. Recentemente, têm sido desenvolvidos esforços para o desenvolvimento de novas metodologias avançadas para o tratamento de feridas crónicas, incluindo a aplicação tópica de fatores de crescimento ou terapias baseadas em células. Em muitos casos, estas novas abordagens são caras, devendo ser realizadas numa unidade hospitalar, e a sua eficácia terapêutica é baixa. Assim, o desenvolvimento de novas soluções para satisfazer esta necessidade clínica ainda não satisfeita é absolutamente necessário. Com este trabalho pretende se desenvolver um penso curativo eficiente, inovador, fácil de usar e não dispendioso, através de uma abordagem segura, visando uma cicatrização mais rápida e adequada da ferida. A nanocelulose bacteriana (BNC) demonstrou já resultados positivos no tratamento de diferentes tipos de feridas, assim como foi já demonstrado também o seu potencial como sistema de entrega de fármacos. Neste trabalho, a BNC foi utilizada como veículo para a libertação controlada de moléculas hidrofóbicas, nomeadamente a vitamina D3 (Vit D3 ), que é um indutor da expressão endógena do peptído antimicrobiano LL37, conhecido por acelerar o processo de cicatrização de feridas. Além disso, a BNC funciona como uma barreira protetora contra agentes exógenos (poeiras, microorganismos) que podem prejudicar a cicatrização de feridas. Numa primeira parte, foram desenvolvidos trabalhos visando tornar a produção em grande escala de BNC em cultura estática económica e viável. Nesse sentido, foi usado um desenho experimental, baseado na metodologia de superfície de resposta (RSM) - planeamento composto central (CCD) - para otimizar o meio de cultura, usando subprodutos da indústria alimentar. Foi utilizada a estirpe Komagataeibacter xylinus BPR 2001, a 30 ºC. Foram identificadas as seguintes condições ótimas para a produção de BNC (% (m/v)): melaço 5,38, xarope de milho (CSL) 1,91; sulfato de amónio 0,63; fosfato dissódico 0,270; ácido cítrico 0,115 e etanol 1,38 % (v/v). Os rendimentos máximos experimentais e previstos de produção de BNC foram 7,5 ±0,54 g/L e 6,64 ±0,079 g/L, respetivamente, após 9 dias. Adicionalmente, foram avaliados o efeito da área superficial e da profundidade/altura do meio de cultura no rendimento e produtividade em BNC. Verificou-se que a produção de BNC aumenta com a área superficial, com o volume de meio de cultura (profundidade) e com o tempo de fermentação. Além disso, observou-se que a produtividade de BNC se mantém constante até se esgotarem os nutrientes no meio de cultura. Para a etapa de preparação pré-inóculo (PIP), a otimização consistiu em diferentes estudos, especificamente: (a) otimização dum meio de cultura de custos reduzidos, que permita a obtenção de uma elevada densidade celular; (b) avaliação do efeito da concentração celular inicial na produção estática de BNC e (c) estudo da cinética de crescimento celular ao longo das diferentes etapas de PIP. A melhor composição para o PIP foi (% (m/v)): xarope de glucose e frutose 1,5- 2,0; CSL 0,7; ácido cítrico 0,115 e Na2HPO4 0,27. Os estudos de cinética de crescimento celular para as diferentes etapas do PIP evidenciam a necessidade dum controle cuidadoso do tempo de cultura em cada etapa do PIP. O tempo necessário para atingir a fase exponencial foi muito diferente em cada fase do PIP, reduzindo significativamente da cultura estática, para a cultura agitada, e para cultura agitada em larga escala num bioreator de 75 L. A segunda parte do trabalho relaciona-se com o desenvolvimento da BNC como sistema de entrega de fármacos. A Vit D3 é pouco solúvel em água e, portanto, não é facilmente incorporada no ambiente altamente hidrofílico como o da membrana de BNC. Para esse efeito foi usado um nanogel anfifílico auto-organizado obtido pela ligação de hexadecilamina (Hexa) na cadeia do ácido hialurónico (HA). A Vit D3 foi então encapsulada no nanogel de (HA-Hexa) e em seguida impregnada na membrana de BNC, com uma eficiência de encapsulação entre 60-91 %. A libertação da Vit D3 foi monitorizada ao longo do tempo, usando uma célula de Franz e realizando estudos de permeação. Observou-se a libertação de cerca de 70 % da Vit D3 , ainda dentro do nanogel de HA-Hexa, das membranas de BNC em 48h. Finalmente, foi testada a utilização de HA-Vit D3 e de HA-LLKKK18 (um péptido análogo à LL37) em modelos de feridas de excisão e crónicas em ratinhos tratados com dexametasona e diabéticos tipo II (db + / db +) C57BL/6. No entanto, os resultados não revelaram uma maior eficiência na cicatrização de feridas na presença das referidas formulações.