Biotic stress in grapevine – elucidation of the role of the newly identified SWEET transporters on plant-pathogen interaction

Abstract

Os açúcares desempenham funções vitais nos seres vivos, principalmente como fontes de carbono e de energia, mas também como reguladores osmóticos e como moléculas sinalizadoras. Em particular, na videira (Vitis vinífera L.), a qualidade do vinho depende dos níveis de açúcar nos bagos de uva porque determinam a concentração em etanol e influenciam a síntese de compostos secundários (incluindo pigmentos). Diferentes famílias de transportadores membranares presentes no genoma das plantas desempenham um papel essencial na translocação de açúcares entre os tecidos fotossintéticos e os tecidos de armazenamento. Entre eles, os transportadores denominados SWEET (Sugars Will Eventually be Exported Transporter), recentemente identificados, têm revelado diferentes papéis em mecanismos fisiológicos onde o efluxo de açúcar é fundamental, como nos nectários. Na videira, a família SWEET compreende 17 membros. No presente estudo pretendeu-se elucidar o papel dos VvSWEETs na resposta da videira à infeção por fungos (Botrytis cinerea e Erysiphe necator) e ao stresse abiótico, incluindo a secura. Além disso, para estudar os papéis fisiológicos do VvSWEET7 e VvSWEET15, foram aplicadas diferentes técnicas de engenharia genética de plantas, tal como CRISPR-Cas9. Em particular, na variedade Trincadeira, susceptível ao fungo B. cinerea, e na variedade Carignan, susceptível a E. necator, foram analisadas em detalhe as modificações no perfil de expressão dos SWEETs em bagos de uva infetados. Os resultados mostraram que a infeção por E. necator causa modificações mais pronunciadas na expressão dos VvSWEETs do que a infecção por Botrytis. Por outro lado, a maioria dos SWEETs da videira foram regulados negativamente em bagos de uva em resposta à secura, no entanto, o VvSWEET10 e VvSWEET11 foram regulados positivamente. Foi também observado que a expressão do VvSWEET1, VvSWEET4 e VvSWEET11 é regulada positivamente em folhas tratadas com caulino (filme inerte usado para proteger as videiras em situações de deficit hídrico, de radiação solar extrema e de ondas de calor), sugerindo que este mineral estimula a capacidade de transporte de sacarose entre os tecidos fotossintéticos e os tecidos de armazenamento. Estudos subsequentes mostraram que os genes VvSWEET11 e VvSWEET15 são positivamente regulados em bagos de uva submetidos a temperaturas de 50ºC durante 7 dias, tratamento normalmente usado para a produção de uvas passas. Uma vez que os níveis de transcritos dos genes VvSWEET7 e VvSWEET15 foram elevados nos bagos de uva e aumentaram em resposta à infeção por Botrytis, as proteínas VvSWEET7 e VvSWEET15 foram alvo de estudos adicionais para se avaliar a sua localização sub-celular e função. As proteínas de fusão VvSWEET7-GFP e VvSWEET15- GFP foram transitoriamente expressas em células da epiderme de Nicotiana benthamiana e os resultados de microscopia confocal mostraram que ambas as proteínas se localizam claramente na membrana plasmática. Após expressão heteróloga numa estirpe mutante de Saccharomyces cerevisiae (hxt-null), a proteína VvSWEET7 foi caracterizada funcionalmente como um transportador de glucose e de sacarose (Km =15,4 mM glucose e Km = 40,1 mM sacarose). Ensaios de inibição competitiva mostraram que o manitol e o sorbitol inibem o transporte de D-[14C(U)]- glucose, sugerindo que, além de mono- e de dissacarídeos, o VvSWEET7 medeia o transporte de polióis. No presente trabalho foram ainda identificados no genoma da videira 18 membros da família de transportadores de açúcares denominada ERD6like e a proteína VvERD6l13 foi alvo de um estudo mais aprofundado. A proteína de fusão VvERD6l13-GFP foi transitoriamente expressa em folhas de N. benthamiana após transformação mediada por Agrobacterium e os resultados de microscopia de fluorescência mostraram que se localiza na membrana plasmática. Estudos de transporte de açúcares marcados radioativamente, após expressão heteróloga em leveduras mutantes (hxt-null), mostraram que a proteína VvERD6l13 é um transportador de sacarose com protões (Km = 33 mM). O gene VvERD6l13 é fortemente regulado em bagos de uva infetados com Botrytis ou E. necator, sugerindo que a proteína VvERD6l13 tem um papel importante durante a interação planta-patógeno. Além disso, o VvERD6l13 é expresso em diferentes tecidos da videira, em particular na raiz. Genericamente, os resultados mostraram que os transportadores VvSWEET e o VvERD6l desempenham um papel importante na mobilização de açúcares durante o desenvolvimento dos bagos de uva e que a sua expressão é regulada ao nível da transcrição em resposta ao stresse biótico e abiótico. No seu conjunto, estes resultados ajudam a compor o puzzle complexo dos mecanismos de resposta da videira aos stresses biótico e abiótico, abrindo ainda caminhos novos e desafiadores no tópico do transporte transmembranar em plantas.

Sugars perform vital functions in the living world, primarily as sources of carbon and energy, but also as osmotic regulators and signaling molecules, among others. This is particularly relevant in the grapevine (Vitis vinifera L.) as the quality of the wine depends on the sugar concentration in the grape berry as it determines the final concentration in ethanol, but is also tightly related to the amount of secondary compounds (including pigments) synthesized during ripening. Different sugar transporter families are present in the genome of plants to fulfill the task of transmembrane sugar transport, which is pivotal for long distance transport between sources and sinks. Among these, the newly identified SWEETs transporters (from Sugars Will Eventually be Exported Transporter) have important roles in numerous physiological mechanisms where sugar efflux is critical. In grapevine, the SWEET family comprises 17 members. In this study, the main objective was to elucidate the role of VvSWEETs in grapevine response to fungal attack (Botrytis cinerea or Erysiphe necator infection) and abiotic stress, including drought. Also, to further study the physiological roles of VvSWEET7 and VvSWEET15, different plant genetic engineering techniques, such as CRISPRCas9, were used. In the B. cinerea-susceptible cv. Trincadeira and in the E. necator-susceptible cv. Carignan, modifications in the gene expression profile of SWEETs in infected grape berries were thoroughly analyzed. Overall, results showed that E. necator infection caused more pronounced modifications in VvSWEET gene expression than Botrytis infection. Moreover, the majority of grapevine SWEET genes were down-regulated in berries from droughtstressed vines of cv. Tempranillo, while VvSWEET10 and VvSWEET11 were up-regulated. In kaolin-treated leaves the expression of VvSWEET1, VvSWEET4 and VvSWEET11 was up-regulated, suggesting that this chemically inert mineral used to protect vines from radiation, drought and heat stimulates sucrose transport capacity improving source-to-sink transport of sucrose. Results also showed that VvSWEET11 and VvSWEET15 were strongly up-regulated in berries subjected to 50ºC during 7 days, a protocol normally used to produce raisins. Following the observation that VvSWEET7 and VvSWEET15 were strongly expressed in berries and clearly up-regulated in response to Botrytis infection in cv. Trincadeira, they were subjected to additional studies to evaluate the subcellular localization and function of the encoded proteins. VvSWEET7-GFP and VvSWEET15-GFP fusion proteins were transiently expressed in Nicotiana benthamiana epidermal cells after Agrobacterium-mediated transformation and both proteins clearly localized to the plasma membrane, as assessed by confocal microscopy. VvSWEET7 was functionally characterized after overexpression in an hxt-null Saccharomyces cerevisiae strain as a low-affinity, high-capacity glucose and sucrose transporter, with a Km of 15.4 mM for glucose and 40.1 mM for sucrose. Competitive inhibition experiments showed that mannitol and sorbitol also inhibited D-[14C(U)]-glucose transport, suggesting that, besides mono- and disaccharides, VvSWEET7 mediates the transport of polyols. In the grapevine genome 18 members of the sugar transporter family ERD6l were identified and VvERD6l13 was selected for further characterization. The fusion protein VvERD6l13-GFP was transiently expressed in N. benthamiana leaves after Agrobacterium-mediated transformation. VvERD6l13 is localized in the plasma membrane. When VvERD6l13 was heterologously expressed in an hxt-null S. cerevisiae strain, it was observed that the protein mediates H+-dependent sucrose transport with a Km = 33 mM. VvERD6l13 is strongly up-regulated in infected grape berries with Botrytis or E. necator, suggesting that it plays an important role during pathogen-host plant interaction. Moreover, VvERD6l13 is expressed in different grapevine tissues, but its steady-state transcript levels were particularly high in roots. In sum, VvSWEET and VvERD6l transporters are important players in sugar mobilization during grape berry development and their expression is transcriptionally reprogrammed in response to biotic and abiotic stress. Together, these results constitute a new piece of the complex puzzle that is grapevine interaction with its surrounding environment and existing biological threats, while also opening new and exciting pathways in the plant sugar transporter research topic.