Strategies towards the recreation of a hair follicle regenerative microenvironment

Abstract

The hair follicle (HF) is an exclusive skin appendage with important physiological and aesthetic functions including thermoregulation, physical protection, immunosurveillance and sensory perception. Despite its ability to undergo repeated lifelong cycles of regeneration, new HFs cannot be naturally formed after birth. After a significant injury, the repaired skin lacks this critical appendage, significantly compromising its functionality. In hair associated disorders, the success of the treatments is limited to autologous replacement therapies which are often compromised by the disease itself, including the lack of sufficient follicles available for transplantation. Hair development and cyclical growth are driven by the bidirectional signaling occurring between the epithelial and mesenchymal compartments of the HF. In this dynamic crosstalk, a key population of mesenchymal cells – the dermal papilla (DP) cells – instructs epithelial cells towards hair formation. So far, successful translation of regenerative strategies has been hampered by difficulties associated with the preservation of the trichogenic capacity of these cells during in vitro culture and expansion, which are required to obtain clinically relevant cell numbers. In pursuit of a more accessible epithelial cell source, we explored the use of skin epidermal keratinocytes with stem cell characteristics (EpSlKCs), demonstrating their phenotypic similarity with follicular keratinocytes and capacity to crosstalk with DP cells. To counteract the loss of trichogenic properties that DP cells suffer in culture, we investigated the influence of skin keratinocyte-conditioned medium, physiological oxygen levels, as well as DP native extracellular matrix (ECM) features. We showed that DP cell inductivity and phenotype are partially recovered by culture with keratinocyte- conditioned medium or in ECM biomimetic peptide hydrogels. Moreover, we confirmed that physoxia (5% oxygen) improves the phenotype and functionality of DP cells, which is further enhanced when these cells are directly interacting with melanocytes. Finally, the generation of a human skin in vitro model bearing HF-like structures was pursued. A microfabrication technique was used to support the physical interaction between DP cells and keratinocytes and further elicit their critical crosstalk in a standard organotypic skin model, contributing to the recreation of a HF regenerative microenvironment in vitro. The distinct strategies explored in this thesis provide valuable knowledge, which in the future may contribute to the bioengineering of complete human HFs in vitro or to promote the much desired HF regeneration or HF neoformation in situ.

O folículo piloso (FP) é um apêndice da pele com importantes funções fisiológicas e estéticas incluindo termoregulação, proteção física, imunovigilância e perceção sensorial. Apesar do seu crescimento cíclico, em humanos não é possível formar novos FPs após o nascimento. Após uma lesão grave a nova pele não terá FPs, comprometendo a sua funcionalidade. Além disso, em doenças de foro capilar, o sucesso dos tratamentos é limitado a terapias de substituição autólogas, muitas das vezes comprometidas pela própria doença. A formação e crescimento do pelo são impulsionados pela sinalização bidirecional que ocorre entre os compartimentos epitelial e mesenquimal do FP. Nesta comunicação dinâmica, uma população chave de células mesenquimais – as células da papila dérmica (PD) – instruem as células epiteliais para a formação de pelo. No entanto, a translação de estratégias regenerativas tem sido impedida pela dificuldade em preservar a tricogenicidade destas células durante a sua expansão in vitro, a qual é necessária para obter um número de células clinicamente relevante. Dada a necessidade de uma fonte de células epiteliais mais acessível do que o FP, demonstrámos que uma subpopulação de queratinócitos da pele com características estaminais é fenotipicamente semelhante aos queratinócitos foliculares e capaz de comunicar com as células da PD. No sentido de contrariar a perda de capacidade tricogénica que as células da PD sofrem em cultura, investigámos a influência do meio condicionado de queratinócitos da pele, de níveis de oxigénio fisiológicos (5% oxigénio, O2) e o papel de elementos da matriz extracelular (MEC) da PD no mesmo. Quer a cultura das células da PD com o meio condicionado, quer em hidrogéis funcionalizados com péptidos que mimetizam a MEC da PD, permitiram recuperar parcialmente a indutividade e propriedades nativas destas células. Mais ainda, as condições de 5% O2 melhoraram o fenótipo e funcionalidade das células da PD, efeito este que é realçado quando estas contactam diretamente com melanócitos. Por fim, explorámos a criação de um modelo in vitro de pele humana contendo estruturas morfologicamente semelhantes a FPs. A interação física entre as células da PD e os queratinócitos e, consequentemente, a comunicação entre ambos foi promovida pela microfabricação do hidrogel base de um modelo organotípico de pele, permitindo assim a recriação de um microambiente regenerativo de FP in vitro. As diferentes estratégias exploradas nesta tese permitiram obter novos conhecimentos que, no futuro, poderão contribuir para a bioengenharia de FP humanos in vitro ou para a promoção da tão desejada regeneração ou neoformação de FPs in situ.