Development of a novel recombinant subunit antigen as a vaccination target against candidiasis: Cht3 from Candida albicans

Abstract

Candida is a genus of ubiquitous yeasts commonly found in healthy individuals and normally acting as harmless commensals in their hosts. However, disruption of the immune defenses can lead to an outgrowth of these yeasts and give rise to local or systemic infections. In fact, Candida, mainly C. albicans, is currently responsible for one of the most common causes of fungal infections worldwide, in part due to an increased development of resistance against the few available therapies. Thus there is an urgent need for the elaboration of new therapies, both for prevention and treatment, among which vaccines may have an important role. Recent studies investigating C. albicans cell wall surface proteins (CWSP) as antigens with DODAB:MO liposomes as carriers and adjuvants led to the detection of a chitinase, Cht3p, as an immune response inducer in mice. Nevertheless, the use of one antigen alone can lead to an evasion of the immune system by C. albicans and hence combination of Cht3p with another antigen, such as the previously studied C. albicans protease Sap2p, is needed. In this study, we successfully developed efficient production and purification protocols for the heterologous production of these two C. albicans proteins. Cht3p could not be produced in Escherichia coli but was successfully produced in a glycosylated and active form in Pichia pastoris. Extracellular production in this host allowed a simplified purification involving ammonium sulfate precipitation and dialysis. Sap2p was successfully produced in both the inactive pro-peptide and active forms in E. coli, with highest production for the former. A simplified, reduced cost, non-chromatographic approach for Sap2p purification, which took advantage of the proteins’ low pH stability, was developed and enabled the obtainment of almost 20 times more purified protein than that previously reported. Preliminary studies investigating various liposomal formulations and conditions previously described and optimized for CWSP (Carneiro et al., 2015) were carried out for both proteins. Cht3p was successfully encapsulated while process optimization is needed for both Sap2p alone and in combination with Cht3p. In conclusion, the main objectives of this thesis, efficient expression and purification of both Cht3p and Sap2p was achieved and completed. Although further studies optimizing the encapsulation conditions for each protein are still needed, this work demonstrates that Cht3p can be successfully encapsulated in liposomal nanoparticles.

Candida é um género de leveduras comensais normalmente presente em indivíduos saudáveis. No entanto, quando ocorrem alterações das defesas imunes, pode ocorrer um crescimento anormal destas leveduras que pode resultar no desenvolvimento de infeções locais ou sistémicas. De facto, espécies de Candida, maioritariamente C. albicans, são responsáveis por uma das infeções fúngicas mais comuns a nível mundial, em parte devido a um aumento do desenvolvimento de resistência às poucas terapias existentes. Assim, há uma necessidade urgente para o desenvolvimento de novas terapias, quer de prevenção quer de tratamento, nas quais as vacinas podem vir a ter um papel importante. Foi recentemente publicado que proteínas da parede celular de C. albicans encapsuladas em lipossomas de DODAB:MO levaram ao desenvolvimento de resposta imune contra C. albicans em ratinhos, tendo a proteína Cht3p sido detetada como indutor de resposta. No entanto, o uso apenas deste antigénio numa formulação pode levar a uma evasão do sistema imune por parte de C. albicans, sendo que a combinação de Cht3p com outro antigénio, como o já estudado Sap2p, é necessário. Neste estudo conseguiu-se desenvolver protocolos eficientes de produção e purificação destas duas proteínas produzidas heterologamente. A produção de Cht3p em Escherichia coli não foi possível, no entanto, usando Pichia pastoris, a produção desta proteína na sua forma glicosilada e ativa foi conseguida. A produção extracelular de Cht3p permitiu uma purificação simples através de precipitação com sulfato de amónio e diálise. Em relação a Sap2p, foi possível produzi-la em E. coli quer na forma de pré-proteína inativa, quer na sua forma ativa, com a primeira a apresentar maior produção. O desenvolvimento de um protocolo de purificação simplificado, mais barato e sem recurso a cromatografia, beneficiando da estabilidade a baixos pHs desta proteína foi desenvolvido, o que permitiu um rendimento cerca de 20 vezes superior comparativamente a estudos anteriores. De seguida, testouse preliminarmente o desenvolvimento de várias formulações lipossomais, usando condições otimizadas para o encapsulamento de proteínas totais da parede celular de C. albicans (Carneiro et al., 2015). A proteína Cht3p foi encapsulada com sucesso enquanto que o encapsulamento de Sap2p sozinha ou em combinação com Cht3p precisa de ser otimizado. Concluindo, os principais objetivos desta tese, a expressão e purificação de Cht3p e Sap2p, foram atingidos. Relativamente aos ensaios de encapsulamento, ainda que sejam necessárias otimizações, este trabalho demonstrou que Cht3p pode ser encapsulada em lipossomas com sucesso.