Defining molecular pathways in antimalarial drug resistance

Abstract

A malária é uma das doenças mais mortíferas do mundo e uma grave ameaça ao progresso das áreas afectadas. O Plasmodium falciparum é um dos parasitas causadores da doença e tem uma elevada capacidade de desenvolver resistência aos fármacos, tornando ineficiente a maioria das terapias. Apenas as terapias de combinação à base de artemisinina resistem como tratamentos eficazes, no entanto estudos recentes apontam para uma redução da sua eficácia. Consequentemente, é necessário identificar os principais marcadores de resistência e compreender a evolução desta. Também é importante compreender e identificar os mecanismos biológicos do parasita para contornar os mecanismos de resistência ou identificar novos alvos eficazes para fármacos. Nesta tese, amostras de ensaios clínicos provinientes de África foram analisadas para marcadores de resistência à piperaquina e foram explorados os padrões transcripcionais do pfk13, o gene mais predicativo da tolerância à artemisinina. Duplicações do gene plasmepsin 2, um marcador associado à resistência à piperaquina no sudeste asiático, foram encontradas em África, indicando uma possível presença de parasitas com mutações favoráveis à emergência da resistência à piperaquina. A análise da resposta transcripcional do pfk13 após tratamento com arteméter-lumefantrina revelou uma correlação entre downregulation do pfk13 e um maior tempo de eliminação de parasitas. Portanto, a resposta transcripcional é um possível mecanismo de tolerância à artemisinina. Para explorar o mecanismo de resistência da piperaquina, este trabalho gerou estirpes de P. falciparum geneticamente modificadas com duplicação da plasmepsina 2 e plasmepsina 3-1. Estes parasitas revelam maior resistência a elevadas concentrações de piperaquina, fenótipo que foi aumentado através da utilização de bloqueadores químicos dos transportadores PfMDR1 e PfCRT. Estes dados sugerem um fenótipo multigénico e uma interacção de múltiplos sistemas presentes no vacúolo digestivo do parasita. Este trabalho também explorou o papel da proteína transportadora citoplasmática PfMRP1, não tendo impacto particular para os fármacos antimaláricos comummente utilizados. Contudo, foi observada resistência a antifolatos num fenótipo incompatível com a anteriormente proposta funcionalidade de exportador. A acumulação de moléculas de antifolatos fluorescentes foi diminuida em parasitas com o gene pfmrp1 interrompido. Através de uma análise filogenética demonstramos que o pfmrp1 encontra-se distante de outros transportadores da mesma classe de vários organismos. Por conseguinte, este trabalho propõem a PfMRP1 como uma proteína importadora.

Malaria is one of the deadliest diseases in the world and a severe threat to the progress of affected areas. Plasmodium falciparum is the parasitic species responsible for most severe malaria cases. This parasite has a high capacity to develop drug resistance. Only artemisinin-based combination therapies still endure as effective treatments, but concerning evidence piles up of decreased efficacy. Accordingly, efforts need to be done to identify key markers of resistance and understand the evolution of resistance in the field. Moreover, the elucidation of the biological mechanisms of the parasite is important to identify and bypass mechanisms of drug resistance or identify new effective drug targets. Field samples from African clinical trials, the continent most ravaged by malaria, were analyzed for piperaquine resistance markers and explored the transcriptional patterns of pfk13, the most predicative gene of artemisinin tolerance. Plasmepsin 2 gene duplication, a marker associated with piperaquine resistance in Southeast Asia, was detected in Africa, indicating possible presence of background favorable for emergence of piperaquine resistance. Analysis of pfk13 transcriptional response after artemether lumefantrine revealed a correlation of pfk13 down-regulation and longer parasite clearance time. Therefore, transcriptional response may be a mechanism of artemisinin tolerance, which is in accordance with recent studies of pfk13 mutations generating resistance through decreased protein expression. To explore the piperaquine mechanism of resistance, this work generated edited P. falciparum strains with duplicated plasmepsin 2 and plasmepsin 3-1 genes. These lines displayed increased resistance to high piperaquine concentrations, an effect that was enhanced by using chemical blockers of PfMDR1 and PfCRT transporters. The data suggest a multigenic phenotype and an interplay of multiple systems present at the digestive vacuole of the parasite. Moreover, these data clarify the likely evolution of piperaquine resistance and together with epidemiological data indicate that an initial selection of plasmepsins duplications and pfmdr1 single copy number could have generated a favorable background for pfcrt mutations to arise and give high-grade resistance to piperaquine. Transporter proteins are key for resistance phenotypes. This work explored the role of the cytoplasmic transporter protein PfMRP1 finding no impact for commonly used antimalarial drugs. However, resistance to antifolate compounds was observed in a phenotype incompatible with the previously proposed exporter functionality. Accumulation of fluorescent antifolate molecules was reduced in pfmrp1 disrupted parasites. Phylogenetic analysis corroborates unusual function with pfmrp1 distant from transporters of the same class of multiple organisms. Therefore, in this work, PfMRP1 is proposed as an importer protein.