Molecular targets underlying benzo[a]phenoxazines antifungal activity: the role of ergosterol metabolism and endoplasmic reticulum stress

Abstract

Com o passar dos anos, as infeções fúngicas têm-se tornado uma questão cada vez mais relevante, particularmente devido ao desenvolvimento de resistência contra as drogas antifúngicas em uso. Recentemente, o nosso grupo tem contribuído para a elucidação do mecanismo de ação de um grupo de compostos químicos com atividade anti-proliferativa, as fenoxazinas e os seus derivados, nomeadamente as benzo[a]fenoxazinas. Trabalhos anteriores do nosso laboratório têm-nos fornecido um vasto conhecimento acerca do mecanismo de ação da benzo[a]fenoxazina BaP1. O BaP1 é capaz de induzir um processo de morte celular regulada, mediado pela permeabilização do vacúolo. As potencialidades exibidas por este composto, levaram o nosso laboratório a iniciar os estudos com um composto semelhante, o C9, que apenas difere do BaP1 numa substituição do sistema aromático nuclear da benzo[a]fenoxazina. Esta pequena diferença estrutural, contudo, teve um grande efeito na atividade do composto, uma vez que o C9 é um agente anti-proliferativo mais potente do que o BaP1. As primeiras abordagens mostram que este pode atuar de uma forma diferente do BaP1. Trabalhos desenvolvidos anteriormente no nosso laboratório já tinham demonstrado que este composto acumula não só na membrana vacuolar, mas maioritariamente na membrana do retículo endoplasmático. Tal como o BaP1, o C9 é capaz de induzir um processo de morte regulada, apesar de, no caso do C9, haver também o envolvimento mitocondrial. Não obstante, o(s) alvo/alvos deste composto continua/continuam por descobrir. De forma a contribuir para a elucidação dos alvos do C9 e, tendo em conta que o seu principal local de acumulação na célula é a membrana do retículo endoplasmático, colocamos a hipótese de que o metabolismo do ergosterol, nomeadamente, a sua via de biossíntese, pode estar envolvido no modo de ação do C9. Contrariamente ao que foi inicialmente proposto, observou-se que uma suplementação externa de ergosterol no meio durante o tratamento com o C9 poderá ter um papel efetor nos efeitos nocivos do C9 no crescimento celular, não tendo, no entanto, qualquer efeito na viabilidade das mesmas. Finalmente, mostramos que o mecanismo de ação do C9 não é mediado pelo stresse do retículo endoplasmático nem pela depleção do ergosterol membranar.

Over the years, fungal infections have become a great source of concern, especially due the development of resistance against antifungal drugs. In line with this, the necessity to develop new antimicrobial drugs that can maintain their potency and have a broad spectrum of targets arises. Recently, our group has been making efforts to unravel the mechanism of action of a group of chemical compounds with antiproliferative activity, phenoxazines and their derivatives, namely benzo[a]phenoxazines. Previous work in our laboratory has provided us a vast knowledge regarding the mechanism of action of a benzo[a]phenoxazine called BaP1. This compound is able to induce a regulated cell death process, mediated by the permeabilization of the vacuole. Such an interesting information lead our laboratory to begin the studies on a similar compound called C9, that only differs from BaP1 on a substitution of the core benzo[a]phenoxazine aromatic system. Remarkably, this small structural difference has a big effect on the action of the compound, since C9 is a much more potent antiproliferative agent than BaP1. The first approaches showed that it may act in a different manner than BaP1. It has already been demonstrated that this compound accumulates not only in the vacuolar membrane, but mostly in the endoplasmic reticulum membrane. Like BaP1, C9 is able to induce a regulated cell death process, although in the case of C9 there is also a mitochondrial involvement. Nonetheless, the target/targets of this compound is/are still unknown. Aiming to fully elucidate this compound’s target(s), and bearing in mind that its main site of accumulation in the cell is the endoplasmic reticulum membrane, we hypothesized that ergosterol metabolism, namely ergosterol biosynthetic pathway, could be involved in this compound’s antifungal action. Contrarily to what we first purposed, we observed that an external supplementation of ergosterol to the medium after C9’s treatment may have an effector role on C9’s deleterious effects on cell growth, while being harmless to the cell’s viability. Finally, we demonstrated that C9’s mechanism of action is not mediated by ER stress, nor through membrane ergosterol’s deletion.