Unveiling the production of metabolites with flavor enhancement through genome-scale metabolic modelling of a lambic beer microbial community

Abstract

Systems biology studies biological processes on a global scale, involving different omics. It uses bioinformatic approaches, such as the reconstruction of genome-scale metabolic models to understand the biological system of a cell, organism, or microbial community. Genome-scale metabolic models are metabolic models based on the well-known stoichiometry of biochemical reactions. It offers a whole system view, predicting the metabolic phenotype, based on the genome and biochemical information. These models haves several applications in different areas such as biotechnological and pharmaceutical. Lambic beers are commercial beers from Belgium that still use old brewing styles. This type of beer is gaining interest worldwide due to its unique flavour profile obtained by a mixed yeast-bacteria culture fermentation. Therefore, in this thesis, the lactic acid bacterium Pediococcus damnosus and Brettanomyces bruxellensis yeast, which play an important role in the acidification and maturation phase of the lambic beer fermentation, will be studied. Pediococcus damnosus is a gram-positive bacterium belonging to the lactic acid bacteria group commonly found in brewery environments. Pediococcus damnosus produces only lactate by the sugar metabolism, which confers an acidic and tart flavour to the beer. In turn, Brettanomyces bruxellensis is a facultatively anaerobic yeast, also responsible for the typical aroma of lambic beer. It uses several carbon sources and produces several volatile phenolic compounds not desired in common fermentations crucial in this type of beer. Usually, in nature, the microorganisms appear in communities. Thus, the study of microbial communities is essential to understand their development, interaction and evolution. The main aim of this thesis is to unveil the production of metabolites with flavour enhancement in the acid lambic beer through the reconstruction and simulation of genome-scale metabolic models for each microorganism and therefore for the microbial community composed by them, to understand the interactions between the species and how these affects the lambic beer flavour. Two genome-scale metabolic models were reconstructed: the model of the bacterium Pediococcus damnosus and the model of the yeast Brettanomyces bruxellensis. The tool used for model reconstruction was merlin, which automates several reconstruction processes and having a user-friendly interface. The Pediococcus damnosus genome-scale metabolic model consists of 809 reactions and 589 metabolites. In turn, the Brettanomyces bruxellensis genome-scale metabolic model has 2095 reactions and 1249 metabolites. In the simulations performances, the genome-scale metabolic models showed the ability to grow in the minimal medium provided, as described in the literature. Furthermore, simulations predicted the production of certain compounds, such as butanediol in the bacterium Pediococcus damnosus and 4-ethylphenol in the yeast B. bruxellensis, which may influence the Lambic beer flavour. Interactions between the genome-scale metabolic models, especially amino acid exchanges, were predicted. The model of the Pediococcus damnosus-Brettanomyces bruxellensis community was assembled using ReFramed. The community model’s simulation results show that the interaction of these microorganisms results in the production of compounds that may flavour and thus be responsible for the unique flavour profile of Lambic beer.

A biologia de sistemas estuda os processos biológicos numa escala global, envolvendo diferentes ómicas. Utiliza abordagens bioinformáticas, como a construção de modelos metabólicos à escala genómica, de modo a perceber o sistema biológico de uma célula, organismo ou comunidade microbiana. Os modelos metabólicos à escala genómica são baseados na estequiometria bem conhecida das reações bioquímicas de um dado organismo. Oferece uma perspetiva do sistema como um todo, sendo capaz de prever o fenótipo do metabolismo, baseando-se no genoma e em informações bioquímicas. Estes modelos tem várias aplicações em diferentes áreas como a indústria biotecnológica e farmacêutica. As cervejas lambic são cervejas comerciais típicas da Bélgica que ainda utilizam processos de produção de cerveja antigos. Esta cerveja tem vindo a ganhar interesse a nível mundial devido ao seu perfil aromático único que é obtido através da fermentação de uma cultura de bactérias e leveduras. Nesta tese serão estudadas a bactéria ácida láctica Pediococcus damnosus e a levedura Brettanomyces bruxellensis, que possuem um papel importante nas fases de acidificação e maturação da fermentação desta cerveja. Pediococcus damnosus é uma bactéria gram-positiva que pertence ao grupo das bactérias ácidas lácticas e é geralmente encontrada em ambientes de fermentação de cerveja. A bactéria Pediococcus damnosus produz apenas lactato pelo metabolismo dos açucares, conferindo um sabor ácido e azedo à cerveja. Por sua vez, a levedura Brettanomyces bruxellensis é uma levedura anaeróbica facultativa, também responsável pelo aroma típico da cerveja lambic. Utiliza inúmeras fontes de carbono e produz muitos compostos fenólicos voláteis que não são desejados em fermentações comuns, mas são cruciais neste tipo de cerveja. Geralmente, os microrganismos aparecem na natureza, em comunidades. O estudo de comunidades microbianas é importante para perceber o seu desenvolvimento, interação e evolução. O objetivo desta dissertação de mestrado é encontrar metabolitos que conferem o aroma característico da cerveja ácida lambic, de modo a melhorar a sua produção, usando para isso construção e simulação de modelos metabólicos à escala genómica para cada microrganismo e para a comunidade microbiana, de forma a perceber as interações entre espécies e como estas influenciam o aroma da cerveja lambic. Assim foram construídos dois modelos metabólicos à escala genomA ferramenta utilizada para a construção destes modelos metabólicos à escala genómica foi o merlin, uma vez que automatiza vários processo de construção e possui um interface intuitiva. O modelo metabólico à escala genómica da bactéria Pediococcus damnosus é constituído por 809 reações e 589 metabolitos. Por sua vez, o modelo metabólico à escala genómica da levedura Brettanomyces bruxellensis possui 2095 reações e 1249 metabolitos. Nas simulações executadas, os modelos metabólicos à escala genómica mostraram capacidade de crescer no meio mínimo fornecido, como descrito na literatura. Além disso, as simulações preveram a produção de certos compostos, como o butanodiol na bactéria Pediococcus damnosus e o 4-etilfenol na levedura B. bruxellensis, que podem influenciar o sabor da cerveja Lambic. Foram previstas interações entre os modelos metabólicos à escala genómica, sobretudo trocas de aminoácidos. O modelo da comunidade Pediococcus damnosus-Brettanomyces bruxellensis foi construído usando o ReFramed. Analisando os resultados da simulação do modelo da comunidade, pode-se concluir que a interação dos dois microorganismos resulta na produção de compostos que tem a capacidade de conferir sabor e assim serem responsáveis pelo aroma tão único da cerveja lambic.