Carbon nanotubes-reinforced cell-derived matrix-silk fibroin hierarchical scaffolds for bone tissue engineering applications

Abstract

As lesões ósseas são o tipo lesões traumáticas mais comuns. O processo regenerativo do osso é um processo biológico complexo que é influenciado por vários fatores. Atualmente, os autoenxertos representam o padrão mais elevado da medicina regenerativa óssea, contudo apresentam várias desvantagens, tais como disponibilidade limitada do tecido dador ou necessidade de intervenção cirúrgica adicional para colheita do tecido dador. Assim, na área da engenharia de tecidos do osso têm-se procurado desenvolver novos sistemas artificiais que simultaneamente enderecem esta problemática e consigam mimetizar com maior precisão o tecido nativo. Neste trabalho, as excelentes propriedades regenerativas da fibroína de seda foram combinadas com nanotubos de carbono e uma matriz descelularizada derivada de células para a obtenção de novas matrizes porosas (scaffolds) e hierarquizadas para aplicação em abordagens da engenharia do tecido ósseo. Estes scaffolds foram fabricados recorrendo ao método de reticulação enzimática, modelagem através de congelamento e descelularização. A caracterização físico-química revelou que os poros do scaffold tinham cerca de 112 ± 22 µm e este apresentava uma porosidade total de 75 ± 3%. Para além disso, observou-se que os scaffolds possuem um E’ a rondar os 5 kPa, e que são bioativos, in vitro. Adicionalmente, os estudos ex vivo de avaliação do possível comportamento hemolítico revelaram que os scaffolds não possuem qualquer efeito hemolítico. Por sua vez, os estudos realizados in vitro envolvendo o uso de células estaminais obtidas da gordura humana (hASCs) mostraram que os scaffolds são capazes de suportar a proliferação celular. Para além disto, apesar do nível de atividade metabólica exibido pelas células nos scaffolds desenvolvidos ser semelhante aos scaffolds só de fibroína de seda, foi observada uma atividade da ALP superior. Por sua vez, a análise histológica mostrou que células foram capazes de migrar para o interior dos scaffolds e a produzir colagénio. A expressão de vários marcadores osteogénicos, tais como a ALP, OPN, Runx-2 e Col Iα, também foi observada confirmando assim o potencial osteogénico dos scaffolds desenvolvidos. Em suma, os scaffolds hierárquicos desenvolvidos neste trabalho mostraram um alto potencial para uso em abordagens da engenharia de tecido ósseo.

Bone injuries are the most common traumatic injuries. The regenerative process of bone healing is a complex biological process that is influenced by several factors. The current gold standard in bone regenerative medicine are autografts which present several drawbacks, such as limited supply or donor-site morbidity. Thus, in the field of bone tissue engineering, the development of new scaffold systems that addresses the current limitations and more closely mimic the native tissue is being pursued. In this work, the excellent regenerative properties of silk fibroin were combined with carbon nanotubes and decellularized cell derived extracellular matrix to obtain new scaffolds for bone tissue engineering applications. These easy to produce scaffolds were fabricated using enzymatic cross-liking, freeze modeling and decellularization methods. The physicochemical characterization revealed that the developed scaffolds presented pores with ≈ 112 ± 22 µm in size and a total porosity of ≈ 75 ± 3%. Furthermore, scaffolds presented an E’ of ≈ 5 kPa and were bioactive in vitro. Additionally, ex vivo hemolytic assay evidenced that scaffolds expressed no hemolytic effect. Regarding biological evaluation, the cellular in vitro studies performed on adipose-derived stem cells (hASCs) showed that scaffolds supported cell proliferation. Besides, despite the hASCs seeded on developed scaffolds evidenced similar metabolic activity to standard silk fibroin scaffolds, they presented an increased ALP activity. Moreover, the histological stainings showed that cells were capable to migrate into the scaffolds and produce de novo collagen. The expression of several osteogenic markers such as ALP, OPN, Runx-2 and Col Iα was also verified, further supporting the osteogenic potential of the developed scaffolds. Overall, the hierarchical scaffolds produced in the present work show great promise for finding applications in bone tissue engineering.