Ecological interactions in Pseudomonas aeruginosa - Staphylococcus aureus mixed biofilms: deciphering co-infection in cystic fibrosis airways

Abstract

A fibrose cística (FC) é uma doença caracterizada por elevadas taxas de morbidade e mortalidade associadas a infeções microbianas pulmonares. O estudo das interações que se estabelecem entre P. aeruginosa e S. aureus é particularmente importante, uma vez que estas duas bactérias são clinicamente as mais relevantes nas infeções associadas a FC. Este projeto de doutoramento teve como objetivo principal compreender o papel das interações que se estabelecem entre estas bactérias quando em biofilmes polimicrobianos e perceber o seu contributo para a virulência e persistências de infeções em FC. Através de uma abordagem in silico, os dados de interação entre P. aeruginosa e S. aureus foram curados e sistematicamente organizados numa nova base de dados, a Inter-Species CrossTalk Database (www.ceb.uminho.pt/ISCTD). A análise das redes reconstruídas permitiu identificar entidades chave envolvidas na regulação das interações e, por integração com a base de dados PCQuorum, reconhecer potenciais alvos terapêuticos e possíveis moléculas inibidoras. Os estudos experimentais demostraram que, em biofilmes duplos, P. aeruginosa foi a espécie dominante e induziu S. aureus para um estado viável mas não cultivável (VBNC), promovendo assim a sua coexistência. Pela análise do transcriptoma identificou-se um aumento da expressão de genes de virulência de S. aureus, sugerindo que o estado VBNC pode, em parte, justificar a patogenicidade de S. aureus e, assim, influenciar o resultado das estratégias terapêuticas das infeções associados a FC. A coexistência das bactérias nos consórcios polimicrobianos e a diferenciação de S. aureus para o estado VBNC continuou a manifestar-se após tratamento antimicrobiano, tendo-se observado, ainda, um aumento da tolerância dos biofilmes duplos, sugerindo que as espécies interagem sinergisticamente. Nos biofilmes duplos P. aeruginosa induziu ainda a formação de small colony variants por S. aureus, ainda que numa prevalência baixa, não sendo claro o papel deste fenótipo na resposta do consórcio aos antibióticos. O uso de um modelo in vivo-like, desenvolvido e otimizado para desenvolver coinfecção em células epiteliais, permitiu constatar que, na presença destas, as bactérias continuaram a coexistir, passando, contudo, S. aureus a predominar no consórcio. Verificou-se, ainda, que a sobrevivência intracelular aumentou significativamente quando ambas as bactérias co-infetaram o hospedeiro, e que o efeito citotóxico nas células epiteliais foi menor. Os dados resultantes deste projeto de doutoramento mostraram que P. aeruginosa e S. aureus estabelecem uma interação de coexistência não competitiva, com benefício de ambas, mesmo quando os consórcios foram expostos a antibióticos e co-infetaram as células epiteliais, revelando uma nova faceta nas interações ecológicas estabelecidas entre estes microrganismos, tradicionalmente considerados competidores. Estes dados evidenciam, de forma clara, o papel das interações estabelecidas entre espécies na virulência e persistência de bactérias, e de como estas podem afetar a progressão e o resultado terapêutico da infeção.

Cystic Fibrosis (CF) disease is characterized by high rates of morbidity and mortality caused mostly by pulmonary infections. Of particular interest is the interaction established between P. aeruginosa and S. aureus, the two most prominent bacteria in the CF lung. As such, the main aim of this PhD thesis was to decipher the ecological interactions of these pathogens and appraise how they contribute to virulence and persistence traits in the context of polymicrobial biofilm infections. Firstly, by using an in silico approach, experimental data on the molecular basis of P. aeruginosa - S. aureus interactions were systematically organized in the new Inter-Species CrossTalk Database (www.ceb.uminho.pt/ISCTD). Reconstructed networks revealed key entities regulating P. aeruginosa and S. aureus interactions and disclosed important information on potential therapeutic targets and their respective reported inhibitors when integrated with the PCQuorum Database. Experimental data demonstrated that, in dual-species biofilms, P. aeruginosa dominated the consortia and triggered the switching of S. aureus to a viable but non-cultivable (VBNC) state promoting their co-existence. The transcriptomic analysis revealed an increased expression of key genes associated with S. aureus virulence, suggesting that the phenotypic switching to VBNC state might account for S. aureus pathogenicity and, in turn, influence the clinical outcome of the infection. Additionally, P. aeruginosa – S. aureus coexistence led to an increased tolerance of the consortia towards antibiotics, with S. aureus preserving its VBNC phenotype, indicating that both bacteria can even interact synergistically. Under dual-species biofilms with P. aeruginosa, S. aureus also diversifies into small colony variants, however its role in the response to antimicrobial treatment was unclear. The use of an in vivo-like model, engineered to develop co-infection on epithelial cells, allowed to notice that both species continue co-existing, though S. aureus became the dominant bacteria in the consortia. Furthermore, the intracellular survival of both bacteria significantly increased during co-infection, as compared to mono-infection, and, surprisingly, the cytotoxic effect of both species on host seemed to be delayed. Together, this PhD project pointed out a non-competitive co-existence of P. aeruginosa and S. aureus in a CF environment, in which both bacteria had mutual benefits even when challenged by antibiotics or in the presence of host cells, disclosing new ecological facets of interaction between these two species traditionally thought of as competitors. These new findings illustrate how inter-species interactions play a key role in bacterial virulence and persistence, which may subsequently rule infection progression and outcome.