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https://hdl.handle.net/1822/82262
Título: | Development of a phage-based lab-on-chip for the multiplex detection of bloodstream pathogens |
Outro(s) título(s): | Desenvolvimento de um lab-on-chip baseado em fagos para deteção múltipla de agentes patogénicos da corrente sanguínea |
Autor(es): | Costa, Susana Patrícia Chaves |
Orientador(es): | Carvalho, Carla Alexandra Oliveira Cunha Medeiros Freitas, Paulo Conde, João Pedro |
Palavras-chave: | Bloodstream infections Microfluidics Phages Phage proteins Photodiodes Bacteriófagos Fotodíodos Infeções no sangue Microfluídica Proteínas fágicas |
Data: | 18-Jan-2023 |
Resumo(s): | Bloodstream infections (BSIs) are characterized by high incidence and mortality and thus can greatly impact healthcare systems. The prompt administration of antibiotics along with their de-escalation as early as possible are key elements for BSIs effective control. One of the main constraints that limit these actions is the difficulty in detecting the BSIs’ causative agents. The current diagnostic approaches suffer from low specificity, high costs, lack of portability, are time-consuming, and/or require trained personnel for their execution. Thus, it is of paramount importance the development of novel robust methods. Hence, to address this concern, the main goal of this work was to develop a bacteriophage-based lab-on-chip (LoC) platform for multiplex detection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus, which are highly prevalent isolates from BSIs cases. In order to achieve the goal, phage-based probes that present outstanding high specificity, sensitivity, and low-cost production were designed and fused with fluorescent proteins to be used as bacteria recognition elements. These were combined with the advantageous properties of microfluidic devices, such as miniaturization, low sample volume, and portability along with optical sensors due to their sensitivity and easy integration in LoC devices, allowing bacterial detection. In this scope, firstly, a reporter phage with a green fluorescent protein (GFP) for E. coli detection was successfully constructed, nonetheless, it showed a weak fluorescence signal, making unfeasible its use in further experiments. As a surrogate strategy, phage proteins, namely receptor-binding proteins (RBPs) and cell-wall binding domains (CBDs), were developed and fused with fluorescence proteins. Their functional analysis (binding efficiency, sensitivity, and specificity in whole blood) was evaluated using different techniques such as flow cytometry and spectrofluorimetry. In this sense, three recombinant proteins were built: a CBD fused with a GFP that showed to be efficient in the detection of 1-5 CFU/mL of S. aureus after blood culture; an E. coli RBP fused with mCherry that recognized cells in distinct viability states and detected bacteria in various human biological specimens; an RBP for P. aeruginosa fused with mAmetrine that revealed to be very specific. The RBPs for P. aeruginosa and E. coli were used as probes in a bead-based microfluidic assay for the multiplex detection of both pathogens in whole blood. This miniaturized assay detected 104 CFU/mL in 70 min without enrichment, showing bacterial quantitative capabilities. Lastly, an optical setup based on photodetectors was developed and combined with the phage-based microfluidic assay, allowing the detection of P. aeruginosa in whole blood. Noteworthy, this system presented high specificity, and fastness, and is amenable to being fully automated to be used as a point-of-care device for BSIs diagnosis in healthcare settings. As infeções no sangue (IS) são caracterizadas por uma elevada incidência e mortalidade, tendo por isso grande impacto nas unidades de saúde. A administração correta e atempada de antibióticos é um fator chave para o controle efetivo das IS. A dificuldade em detetar os agentes patogénicos responsáveis pelas IS é uma das principais limitações. As técnicas correntes são demoradas, apresentam baixa especificidade e elevado custo, não oferecem portabilidade, e requerem funcionários especializados. Deste modo, é de extrema importância, o desenvolvimento de novos métodos robustos para a deteção de IS. Para colmatar este problema, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver uma plataforma “lab-on-chip” (LoC) baseada em bacteriófagos para detetar simultaneamente três bactérias, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, as quais são frequentemente isoladas de casos de IS. Para atingir este objetivo, sondas baseadas em fagos, que apresentam uma especificidade excecional, sensibilidade, e baixo custo, foram desenhadas e fundidas com genes de fluorescência para serem empregues como elementos de reconhecimento bacteriano. Estas foram combinadas com as vantagens da microfluídica, tais como miniaturização, portabilidade, juntamente com sensores óticos, devido à sua elevada sensibilidade e fácil integração em dispositivos LoC. Neste contexto, primeiramente um fago repórter possuindo uma proteína fluorescente verde (PFV) foi obtido, no entanto, demonstrou um sinal instável e baixo, impossibilitando a sua utilização posterior. Alternativamente, proteínas de fagos foram desenvolvidas, nomeadamente as proteínas recetoras de ligação (PRL) e domínios de ligação à parede celular bacteriana (DLB), fundidas com genes de fluorescência distintos e caracterizadas funcionalmente (especificidade, sensibilidade, etc.) recorrendo a técnicas como citometria de fluxo e espetrofluorimetria. Neste sentido, três proteínas foram desenhadas: um DLB fundido com PFV, que mostrou ser eficiente em detetar 1-5 UFC/mL de S. aureus em culturas de sangue; uma PRL para E. coli, que demonstrou ser eficaz na deteção de diferentes estados celulares e bactérias em várias amostras humanas; e uma PRL para P. aeruginosa, que revelou elevada especificidade. Um ensaio de microfluídica baseado em esferas e nas PRL de E. coli e P. aeruginosa permitiu a deteção múltipla de 104 UFC/mL demorando 70 min sem enriquecimento, sendo quantitativo. Por último, um sistema ótico baseado em fotodetetores foi construído e juntamente com o ensaio de microfluídica, alcançou a deteção de P. aeruginosa em amostras de sangue com elevada especificidade. O sistema revelou-se rápido e é passível de ser totalmente automatizado com vista à deteção de IS em unidades de saúde. |
Tipo: | Tese de doutoramento |
Descrição: | Tese de doutoramento em Biomedical Engineering |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/82262 |
Acesso: | Acesso embargado (2 Anos) |
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Ficheiro | Descrição | Tamanho | Formato | |
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Susana Patrícia Chaves Costa.pdf Até 2025-01-18 | Tese de doutoramento | 6,6 MB | Adobe PDF | Ver/Abrir |
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