Involvement of mitochondrial proteins in yeast apoptosis

Abstract

In the yeast Saccharomyces cerevisiae, acetic acid triggers a mitochondria-mediated death pathway with apoptotic characteristics. In mammalian cells, the mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP), necessary for the release of pro-apoptotic proteins, is a pivotal event for the activation of the apoptotic cascade in numerous cell death pathways. MOMP is thought to be mediated by a complex of proteins that constitute the permeability transition pore (PTP). Since S. cerevisiae possesses orthologues of the components believed to be involved in mammalian PTP composition/regulation, it was used herein to study such proteins both concerning their role in mitochondrial permeabilization and involvement in the course of cell death. The proteins studied were Por1p (yeast voltage-dependent anion channel, VDAC), Cpr3p (mitochondrial cyclophilin) and Aac1/2/3p (ADP/ATP carrier, AAC). We found that during apoptosis triggered by acetic acid deletion of CPR3 has no effect. Absence of Por1p enhances and absence of AAC proteins decreases acetic acidinduced apoptosis indicating an anti- and pro-apoptotic role, respectively, for these proteins. Moreover, the pro-death role of AAC does not require the ADP/ATP translocase activity. Absence of AAC proteins impairs MOMP and release of cytochrome c, which is degraded along with other mitochondrial inner membrane proteins. We observe that, during acetic acid-induced apoptosis, caspase activation is independent of AAC proteins but strongly dependent on the growth phase of the culture. In addition, a strain deleted for the yeast metacaspase YCA1 shows decreased overall caspase activation but still died exhibiting apoptotic features, supporting the existence of an Yca1p-independent apoptotic pathway. Fragmentation and degradation of mitochondria are common events in mammalian apoptosis. Both fragmentation and degradation are able to strongly affect the course of cell death and a relation has been proposed between these events and MOMP/cytochrome c release. Interestingly, por1Δ cells exhibit fragmented mitochondrial reticulum in the absence of any death stimulus. This phenotype however, does not contribute to the apoptosis stimulation observed in por1Δ mutant. We observe that during acetic acidinduced apoptosis the absence of AAC proteins leads to aggregation of fragmented mitochondria and a slower degradation of these organelles. Degradation of mitochondria in response to acetic acid is not due to classical autophagy or mediated by Uth1p-dependent mitophagy. We show that mitochondrial degradation during acetic acid-induced apoptosis is dependent on the protease Pep4p that is released from the vacuole to the cytosol. pep4Δ cells, which are strongly impaired in mitochondria degradation, are sensitized to acetic acid and mainly die by necrosis. This suggests that mitochondria degradation in response to acetic acid helps to sustain the apoptotic process. Taken together, the results show that vacuolar and mitochondrial proteins interfere with mitochondria morphological remodelling and subsequent degradation, suggesting that there is a complex interplay between these organelles in the regulation of yeast cell death. In conclusion, we were able exploring the distinctive ability of yeast to survive without respiration-competent mitochondria to study the involvement of mitochondria and mitochondria-interacting proteins in cell death. Additional studies using this model will undoubtedly further our understanding of the complex cell death processes.

Na levedura Saccharomyces cerevisiae, o ácido acético desencadeia uma via de morte dependente da mitocôndria com características apoptóticas. Nos mamíferos, a permeabilização da membrana mitocondrial externa (PMME), necessária para a libertação de proteínas mitocondriais pró-apoptóticas, constitui um passo crítico na activação do processo de morte apoptótico. Pensa-se que a PMME seja mediada por um complexo proteico que constitui o poro de transição de permeabilidade (PTP). Uma vez que S. cerevisiae possui ortólogos de algumas das proteínas que se pressupõe compor/regular o PTP de mamíferos, o principal objectivo desta tese foi estudar essas proteínas, tanto ao nível do seu papel na permeabilização mitocondrial bem como do seu envolvimento na execução do processo de morte apoptótico. As proteínas estudadas incluem o canal Por1p (canal de aniões dependente da voltagem, VDAC), a ciclofilina mitocondrial Cpr3p e as três isoformas do transportador Aac1/2/3p (antiportador mitocondrial de ATP/ADP, AAC). A interrupção do gene CPR3 não afecta a morte induzida pelo ácido acético. A interrupção do gene POR1 estimula e a ausência dos genes AAC1/2/3 protege as células da morte apoptótica induzida pelo ácido acético indicando um papel anti- e pró-apoptótico, respectivamente, para estas proteínas. A função das proteínas AAC na morte celular apoptótica não depende da actividade de antiporte. Em células tratadas com ácido acético a ausência das proteínas AAC afecta negativamente a PMME e a libertação de citocromo c, o qual juntamente com outra proteína da membrana mitocondrial interna sofre degradação. Observamos que durante o processo apoptótico induzido pelo ácido acético ocorre a activação de caspases e que esta activação é independente das proteínas AAC e fortemente dependente da fase de crescimento da cultura. Adicionalmente, uma estirpe interrompida na metacaspase de levedura, YCA1, que exibe um decréscimo na activação total de caspases, desencadeia uma morte celular apoptótica. Esta observação suporta a existência de uma via de morte apoptótica independente de Yca1p. A fragmentação e a degradação mitocondrial são eventos comuns no processo apoptótico em mamíferos. Estes eventos podem ter um forte impacto no decurso da morte celular tendo sido proposta uma relação entre estes e a PMME/libertação de citocromo c. Curiosamente, a ausência da Por1p origina uma elevada percentagem de células com o retículo mitocondrial fragmentado mesmo na ausência de qualquer estímulo externo. Este fenótipo, contudo, não parece contribuir para a estimulação da apoptose exibida pela estirpe por1Δ. Durante o processo de morte apoptótico induzido pelo ácido acético, a ausência das proteínas AAC leva à formação de agregados mitocondriais associada a uma menor degradação destes organelos. A degradação mitocondrial durante a apoptose induzida pelo ácido acético não é devida à activação da autofagia clássica, nem mediada pela mitofagia dependente de Uth1p. A degradação mitocondrial induzida pelo ácido acético é dependente da protease Pep4p, que é libertada do vacúolo para o citosol. A estirpe pep4Δ que exibe uma degradação mitocondrial manifestamente diminuída é sensível ao ácido acético, e direcciona o processo de morte para uma forma necrótica. Estes dados sugerem que a degradação mitocondrial favorece a manutenção do processo apoptótico. Globalmente, os resultados evidenciam que proteínas vacuolares e mitocondriais interferem com a morfologia mitocondrial e subsequente degradação e sugerem uma interacção e regulação complexa entre estes organelos durante o processo apoptótico em leveduras. Concluindo, a capacidade de sobrevivência da levedura em condições em que a respiração mitocondrial está afectada ou ausente permitiu a sua utilização como um excelente modelo para a pesquisa do papel de proteínas mitocondriais, ou de proteínas que interactuam com a mitocôndria no processo de morte celular. Estudos adicionais utilizando este modelo irão seguramente contribuir para uma melhor compreensão dos processos de morte celular.