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https://hdl.handle.net/1822/82576
Título: | Design of multifunctional materials to capture pathogens from biological samples |
Outro(s) título(s): | Projeto de materiais multifuncionais para capturar patogénicos de amostras biológicas |
Autor(es): | Sande, Maria Georgina |
Orientador(es): | Rodrigues, L. R. |
Palavras-chave: | Cell-SELEX Electrochemical biosensor Magnetic nanoparticles UspA2 YadA Biossensores eletroquímicos Nanopartículas magnéticas |
Data: | 31-Jan-2023 |
Resumo(s): | Diagnosis of bacterial infections is primarily accomplished by culture and laboratory analysis,
immunological methods and nucleic-acid amplification techniques. However, these methods have
limitations related to affordability, accessibility and time to inform a result. Moreover, the emergence of
antibiotic resistant bacteria comprises a global threat to health, strengthening the relevance of early
detection of pathogens to provide adequate and timely treatments. To address these concerns, point-ofcare
(POC) diagnostic platforms arose as a solution to deliver affordable, equipment-free and rapid
accurate testing especially in resource-limited settings. The combination of cell-SELEX with highthroughput
sequencing and bioinformatic analysis led to the identification of a novel ssDNA aptamer
sequence (Apt1YadA) with high affinity and selectivity towards the adhesin YadA from Yersinia
enterocolitica. An electrochemical aptasensor POC platform was assembled using Apt1YadA on a gold
screen printed electrode which successfully detected recombinant YadA. This was confirmed by cyclic
voltammetry, electrochemical impedance spectroscopy and square wave voltammetry techniques,
attaining a limit of detection of 7.0 × 104 CFU mL−1. The selectivity of Apt1YadA was validated in the
presence of non-target bacteria. A novel aptamer Apt1_RCUspA2 specifically targeting UspA2 adhesin from
Moraxella catarrhalis was also herein identified using a similar workflow. Apt1_RCUspA2 was characterized,
demonstrating high affinity and selectivity towards recombinant UspA2. Likewise, an electrochemical
aptasensor assembled using Apt1_RCUspA2 successfully detected UspA2 with a limit of detection of 4.0 ×
104 CFU mL−1. To further enhance the sensitivity of biosensors, a previous enrichment step of samples,
is envisaged. Since both YadA and UspA2 have an affinity for collagen, magnetic nanoparticles (MNPs)
functionalized with hydrolyzed collagen were synthesized by a quick, green co-precipitation method and
were characterized by ATR-FTIR. The collagen MNPs specifically interacted with YadA and UspA2, with
capture efficacies of 94.7 ± 5.2% and 87.4 ± 4.7%, respectively, providing a viable and efficient tool for
bacterial capture. The results gathered in this thesis contributed to the goal of developing novel POC
platforms and diagnostic workflows for pathogenic biomarkers (YadA and UspA2). Moreover, the
innovative workflows developed, can serve as a prototype for developing similar POC platforms for other
bacterial pathogens. O diagnóstico de infeções bacterianas recorre principalmente a métodos de cultura e análise laboratorial, métodos imunológicos e técnicas de amplificação de ácidos nucleicos. No entanto, estes métodos possuem limitações que se prendem com os seus custos, acessibilidade, e rapidez de resposta. Adicionalmente, o surgimento de bactérias resistentes a antibióticos representa uma ameaça global à saúde, reforçando a relevância da deteção precoce de organismos patogénicos para possibilitar a escolha de tratamentos adequados, atempados e oportunos. As plataformas de diagnóstico rápido (em inglês point-of-care (POC)) surgiram assim como uma solução para fornecer testes precisos, rápidos e acessíveis, sem equipamentos, particularmente relevantes em ambientes com recursos limitados. A combinação da técnica de cell-SELEX com sequenciação em escala e análise bioinformática possibilitou a identificação de um aptâmero novo de ssDNA (Apt1YadA) com alta afinidade e seletividade para a adesina YadA da Yersinia enterocolitica. Foi então desenvolvido um aptasensor eletroquímico usando o Apt1YadA num elétrodo impresso em folha de ouro que permitiu detetar com sucesso a adesina YadA. A deteção desta adesina foi confirmada por voltametria cíclica, espectroscopia de impedância eletroquímica e técnicas de voltametria de onda quadrada atingindo-se um limite de deteção de 7.0 × 104 UFC mL−1. A seletividade de Apt1YadA foi validada também na presença de bactérias não-alvo. De forma similar, foi selecionado um aptâmero Apt1_RCUspA2 visando especificamente a adesina UspA2 de Moraxella catarrhalis. Este aptâmero Apt1_RCUspA2 foi caracterizado, demonstrando alta afinidade e seletividade para a adesina UspA2. Desenvolveu-se então um aptasensor eletroquímico com o Apt1_RCUspA2 que permite detetar com sucesso a adesina com um limite de deteção de 4.0 × 104 UFC mL−1. Como estratégia para incrementar a resposta dos biossensores, é possível ter etapas prévias de enriquecimento das amostras. Tendo em conta que ambas as adesinas, YadA e UspA2, têm afinidade para o colagénio, usou-se colagénio hidrolisado para funcionalizar nanopartículas magnéticas (MNPs) sintetizadas por um método de co-precipitação rápida e verde. As MNPs modificadas foram caracterizadas por ATR-FTIR e verificou-se que as MNPs interagem especificamente com YadA e UspA2, com uma eficácia de captura de 94.7 ± 5.2% e 87.4 ± 4.7%, respetivamente e constituem uma ferramenta viável e eficiente para capturar bactérias de uma amostra mista. Os resultados reunidos nesta dissertação contribuíram para o seu objetivo global de desenvolver novos métodos de diagnóstico rápidos focados em biomarcadores específicos de organismos patogénicos (YadA e UspA2). Adicionalmente, o fluxo de trabalho e racional inovadores que foram aqui desenvolvidos podem no futuro servir como protótipo para o desenvolvimento de biossensores similares para outros organismos patogénicos. |
Tipo: | Tese de doutoramento |
Descrição: | Tese de doutoramento em Chemical and Biological Engineering |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/82576 |
Acesso: | Acesso embargado (2 Anos) |
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Maria Georgina Sande.pdf Até 2025-01-31 | Tese de doutoramento | 6,69 MB | Adobe PDF | Ver/Abrir |
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