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https://hdl.handle.net/1822/82580
Título: | Metabolic Engineering aided by computer-guided enzyme engineering for the optimization of cell factories |
Autor(es): | Oliveira, Joana Filipa Azevedo |
Orientador(es): | Rocha, I. Soares, Cláudio Manuel Simões Loureiro Nunes |
Palavras-chave: | Álcool desidrogenase Engenharia de proteínas Engenharia metabólica Octanol Alcohol dehydrogenase Metabolic engineering Protein engineering |
Data: | 3-Fev-2023 |
Resumo(s): | Atualmente, os álcoois são considerados alternativas atrativas aos combustíveis fósseis. O octanol é um
álcool de 8 carbonos com várias aplicações, incluindo produção de revestimentos e fragâncias e é o
precursor do octeno, um monómero do polietileno de baixa densidade. Dadas as suas propriedades
físico-químicas, o octanol tem também ganho atenção como possível biocombustível. Correntemente, o
octanol é obtido por processos petroquímicos, mas o desenvolvimento de microrganismos para produzir
este álcool tem sido reportado. Embora com baixas concentrações e produtividades, estas fábricas
celulares permitem um método mais limpo de obtenção de octanol. Esta tese visa a elaboração de uma
metodologia que combina estratégias de engenharia de proteínas e engenharia metabólica para melhorar
as propriedades catalíticas de ADHs e o projeto de fábricas celulares robustas para a produção de
octanol. Inicialmente, várias estruturas tridimensionais de álcool desidrogenases (ADHs), uma enzima
que catalisa a conversão reversível do aldeído em álcool, foram avaliadas. Foi estabelecida uma
correlação entre dados estruturais (e.g. composição e volume do local de ligação do substrato) e
cinéticos, permitindo a (re)classificação de enzimas inicialmente classificadas de promíscuas ou com
pouca informação cinética. No grupo de ADHs avaliadas, a AdhP de E. coli foi a enzima escolhida para
ser modificada de forma a usar o octanal como substrato, uma vez que usa NADH como cofator e
apresenta altos níveis catalíticos para uma ampla gama de aldeídos. Através de vários alinhamentos
entre a AdhP e duas ADHs com diferentes afinidades pelo substrato foram indicados três resíduos como
possíveis determinantes da afinidade pelo substrato. Usando métodos de molecular docking, conseguiu
prever-se que as substituições destes resíduos podem melhorar a ligação de substratos grandes. A
validação in vitro destas mutações mostrou que a mutação dupla tem os melhores resultados cinéticos
para o octanal, com uma eficiência catalítica 364-vezes maior que a AdhP nativa. Além disso, observouse
que estas mutações não afetam a termoestabilidade e aumentam a gama de temperatura ótima,
enaltecendo a sua utilização num bioprocesso à escala industrial. Por fim, a produção de octanol foi
conseguida através da expressão de genes heterólogos para a extensão da via de produção de ácidos
gordos de E. coli. A expressão da AdhP mutada foi capaz de produzir 57 mg.L-1 de octanol, 2.6-vezes
mais que a estirpe que contém a AdhP nativa. Foi realizada uma otimização adicional por superexpressão
de etapas limitantes, eliminação de vias competitivas e implementação de uma fermentação de duas
fases para recolher o octanol, resultando numa produção máxima de 119 mg.L-1, o que, no nosso
conhecimento constitui o valor mais alto reportado para E. coli. Em suma, através da combinação de
diferentes áreas científicas, foi possível criar uma enzima otimizada e melhorar a produção de octanol. Nowadays, alcohols are considered attractive alternatives to petroleum-based fuels. Octanol is an eightchain alcohol with several applications, including coating, detergents and fragrances production, and it is a precursor of octene, a monomer of low-density polyethylene. Due to its superior physical-chemical properties, octanol has gained attention as a promising biofuel. Traditionally, octanol is obtained by petrochemical processes, but the development of microorganisms to produce this alcohol as an incipient alternative has been reported. Although with low titers and productivities, these cell factories promise a cleaner method to obtain octanol. This thesis addresses the elaboration of a pipeline combining protein engineering with metabolic engineering approaches to improve the catalytic properties and the design of robust cell factories for octanol production. Firstly, several three-dimensional structures of alcohol dehydrogenases (ADH), an enzyme that catalyses the reverse conversion of aldehyde into alcohol, were evaluated. A correlation between structural features (e.g composition and volume of substrate binding pocket) and kinetic data was established, pointing to a reclassification of enzymes that were initially classified of promiscuous or with little kinetic information. In the ADHs evaluated set, AdhP from E. coli was the chosen enzyme to engineer towards the use of octanal as substrate since it uses NADH as co-factor and has high catalytic levels for a wide range of aldehydes. Through multiple alignments between AdhP and two other ADHs with distinct substrate affinities, three residues were indicated as possible determinants in substrate affinity. Using molecular docking methods, we could predict that the replacement of these residues could improve the binding of large substrates. In vitro validation of mutations in these sites demonstrated that a double AdhP mutant has the best kinetic parameters to octanal, with a catalytic efficiency 364-times higher than the wild-type. Additionally, it was observed that these mutations did not affect the thermostability and enlarged the optimum temperature range, reinforcing its application in an industrial bioprocess. Lastly, octanol production was attained by the overexpression of heterologous genes in an extension of the fatty acid pathway from E. coli. Expression of mutant AdhP was able to produce 57 mg.L-1 of octanol, 2.6-times more than the strain with native AdhP. Further optimization by overexpression of limiting steps, disruption of competing pathways and implementation of a two-phase fermentation to sequester octanol, yielded a maximum of 119 mg.L-1 that, up to our knowledge, is the highest octanol titer described in E. coli. In sum, through the combination of different scientific areas, we were able to create an optimized enzyme and improved octanol production. |
Tipo: | Tese de doutoramento |
Descrição: | Tese de doutoramento em Bioengineering |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/82580 |
Acesso: | Acesso embargado (2 Anos) |
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Joana Filipa Azevedo Oliveira.pdf Até 2025-02-03 | Tese de doutoramento | 6,47 MB | Adobe PDF | Ver/Abrir |
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