Utilize este identificador para referenciar este registo: https://hdl.handle.net/1822/82580

TítuloMetabolic Engineering aided by computer-guided enzyme engineering for the optimization of cell factories
Autor(es)Oliveira, Joana Filipa Azevedo
Orientador(es)Rocha, I.
Soares, Cláudio Manuel Simões Loureiro Nunes
Palavras-chaveÁlcool desidrogenase
Engenharia de proteínas
Engenharia metabólica
Octanol
Alcohol dehydrogenase
Metabolic engineering
Protein engineering
Data3-Fev-2023
Resumo(s)Atualmente, os álcoois são considerados alternativas atrativas aos combustíveis fósseis. O octanol é um álcool de 8 carbonos com várias aplicações, incluindo produção de revestimentos e fragâncias e é o precursor do octeno, um monómero do polietileno de baixa densidade. Dadas as suas propriedades físico-químicas, o octanol tem também ganho atenção como possível biocombustível. Correntemente, o octanol é obtido por processos petroquímicos, mas o desenvolvimento de microrganismos para produzir este álcool tem sido reportado. Embora com baixas concentrações e produtividades, estas fábricas celulares permitem um método mais limpo de obtenção de octanol. Esta tese visa a elaboração de uma metodologia que combina estratégias de engenharia de proteínas e engenharia metabólica para melhorar as propriedades catalíticas de ADHs e o projeto de fábricas celulares robustas para a produção de octanol. Inicialmente, várias estruturas tridimensionais de álcool desidrogenases (ADHs), uma enzima que catalisa a conversão reversível do aldeído em álcool, foram avaliadas. Foi estabelecida uma correlação entre dados estruturais (e.g. composição e volume do local de ligação do substrato) e cinéticos, permitindo a (re)classificação de enzimas inicialmente classificadas de promíscuas ou com pouca informação cinética. No grupo de ADHs avaliadas, a AdhP de E. coli foi a enzima escolhida para ser modificada de forma a usar o octanal como substrato, uma vez que usa NADH como cofator e apresenta altos níveis catalíticos para uma ampla gama de aldeídos. Através de vários alinhamentos entre a AdhP e duas ADHs com diferentes afinidades pelo substrato foram indicados três resíduos como possíveis determinantes da afinidade pelo substrato. Usando métodos de molecular docking, conseguiu prever-se que as substituições destes resíduos podem melhorar a ligação de substratos grandes. A validação in vitro destas mutações mostrou que a mutação dupla tem os melhores resultados cinéticos para o octanal, com uma eficiência catalítica 364-vezes maior que a AdhP nativa. Além disso, observouse que estas mutações não afetam a termoestabilidade e aumentam a gama de temperatura ótima, enaltecendo a sua utilização num bioprocesso à escala industrial. Por fim, a produção de octanol foi conseguida através da expressão de genes heterólogos para a extensão da via de produção de ácidos gordos de E. coli. A expressão da AdhP mutada foi capaz de produzir 57 mg.L-1 de octanol, 2.6-vezes mais que a estirpe que contém a AdhP nativa. Foi realizada uma otimização adicional por superexpressão de etapas limitantes, eliminação de vias competitivas e implementação de uma fermentação de duas fases para recolher o octanol, resultando numa produção máxima de 119 mg.L-1, o que, no nosso conhecimento constitui o valor mais alto reportado para E. coli. Em suma, através da combinação de diferentes áreas científicas, foi possível criar uma enzima otimizada e melhorar a produção de octanol.
Nowadays, alcohols are considered attractive alternatives to petroleum-based fuels. Octanol is an eightchain alcohol with several applications, including coating, detergents and fragrances production, and it is a precursor of octene, a monomer of low-density polyethylene. Due to its superior physical-chemical properties, octanol has gained attention as a promising biofuel. Traditionally, octanol is obtained by petrochemical processes, but the development of microorganisms to produce this alcohol as an incipient alternative has been reported. Although with low titers and productivities, these cell factories promise a cleaner method to obtain octanol. This thesis addresses the elaboration of a pipeline combining protein engineering with metabolic engineering approaches to improve the catalytic properties and the design of robust cell factories for octanol production. Firstly, several three-dimensional structures of alcohol dehydrogenases (ADH), an enzyme that catalyses the reverse conversion of aldehyde into alcohol, were evaluated. A correlation between structural features (e.g composition and volume of substrate binding pocket) and kinetic data was established, pointing to a reclassification of enzymes that were initially classified of promiscuous or with little kinetic information. In the ADHs evaluated set, AdhP from E. coli was the chosen enzyme to engineer towards the use of octanal as substrate since it uses NADH as co-factor and has high catalytic levels for a wide range of aldehydes. Through multiple alignments between AdhP and two other ADHs with distinct substrate affinities, three residues were indicated as possible determinants in substrate affinity. Using molecular docking methods, we could predict that the replacement of these residues could improve the binding of large substrates. In vitro validation of mutations in these sites demonstrated that a double AdhP mutant has the best kinetic parameters to octanal, with a catalytic efficiency 364-times higher than the wild-type. Additionally, it was observed that these mutations did not affect the thermostability and enlarged the optimum temperature range, reinforcing its application in an industrial bioprocess. Lastly, octanol production was attained by the overexpression of heterologous genes in an extension of the fatty acid pathway from E. coli. Expression of mutant AdhP was able to produce 57 mg.L-1 of octanol, 2.6-times more than the strain with native AdhP. Further optimization by overexpression of limiting steps, disruption of competing pathways and implementation of a two-phase fermentation to sequester octanol, yielded a maximum of 119 mg.L-1 that, up to our knowledge, is the highest octanol titer described in E. coli. In sum, through the combination of different scientific areas, we were able to create an optimized enzyme and improved octanol production.
TipoTese de doutoramento
DescriçãoTese de doutoramento em Bioengineering
URIhttps://hdl.handle.net/1822/82580
AcessoAcesso embargado (2 Anos)
Aparece nas coleções:BUM - Teses de Doutoramento
CEB - Teses de Doutoramento / PhD Theses

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