Characterization and engineering of sugar transporters in the yeast Kluyveromyces marxianus for biotechnological applications

Abstract

A utilização sustentável e eficiente de hidrolisados lignocelulósicos por leveduras em biorefinarias, requer o consumo simultâneo de todos os açúcares presentes nesta matéria-prima, nomeadamente, hexoses e pentoses. Este aspeto está, no entanto, limitado pelo baixo número de transportadores específicos para pentoses conhecidos e pela reduzida taxa de consumo de pentoses pela levedura quando a glucose está presente. Kluyveromyces marxianus é uma levedura não convencional que tem atraído atenção considerável devido às suas características com grande interesse industrial, como a capacidade de assimilação natural de pentoses, elevadas termotolerância e taxa de crescimento. Neste contexto, o principal objetivo da presente tese foi estudar o transporte de pentoses em K. marxianus, de forma a selecionar e modificar um transportador que permitisse o co-consumo de glucose e xilose para a aplicação em biorefinarias. A fim de identificar novos transportadores de pentoses, foi criada uma estirpe de K. marxianus, na qual foram eliminados 12 genes que codificavam transportadores da superfamíia MFS (major facilitator superfamily) e que não apresentava crescimento em pentoses (xilose ou arabinose). Usando esta plataforma ΔPT, identificamos vários transportadores de K. marxianus que recuperaram a capacidade da estirpe utilizar xilose e/ou arabinose. Estes transportadores foram caracterizados quanto à cinética de transporte de pentose e glucose utilizando açúcares marcados com 14C. Um destes transportadores mostrou uma alta afinidade tanto para a xilose como para a glucose, embora a afinidade para a glucose ainda fosse 150 vezes maior do que para a xilose. Usando em análise in silico foram selecionamos aminoácidos-alvo deste transportador para mutagénese dirigida, numa tentativa de aumentar a afinidade para a xilose e diminuir o transporte de glucose. Vários mutantes foram construídos e caracterizados por ensaios radioativos e por avaliação do seu crescimento em misturas de açúcares. Um destes mutantes apresentou uma afinidade mais reduzida para glucose aumentando, simultaneamente a sua afinidade para a xilose, mostrando-se muito promissor. A reprogramação bem sucedida deste transportador foi usada para facilitar o co-consumo eficiente de hexoses e pentoses numa nova estirpe de K. marxianus, encurtando significativamente o tempo de fermentação em bioreatores com misturas destes açúcares.

Sustainable and efficient use of lignocellulosic hydrolysates in yeast-based biorefineries requires the simultaneous consumption of all the sugars present in this raw material, hexoses and pentoses. This represents a key bottleneck because of the low number of specific pentose transporters identified and the slow rate of pentose uptake into the yeast cell when glucose is present. Kluyveromyces marxianus is a non-conventional yeast that has attracted considerable attention due to its traits of industrial interest, like the ability of naturally assimilating pentoses, high thermotolerance and fast growth rate. In this thesis, the main goal was to investigate and engineer pentose uptake in K. marxianus to obtain a transporter that would allow co-consumption of glucose and xylose for the application in biorefineries. In order to identify novel pentose transporters, a K. marxianus screening platform (ΔPT) was constructed by deleting 12 genes that encoded transporters of the major facilitator superfamily (MFS). Using this ΔPT platform, which was unable to grow on pentoses, we identified several native K. marxianus transporters that recovered the native strain’s ability to grow on either xylose and/or arabinose. Kinetic studies on the most promising candidates using 14C-labelled sugars were carried on. One member of these transporters showed high affinity for both xylose and glucose, though the affinity for glucose was still 150-fold higher than for xylose. Using in silico analysis we selected target amino acids of this transporter for site-directed mutagenesis in an attempt to convert it into a specific xylose transporter. Several mutants were constructed and characterised by radioactive uptake and growth assays in bioreactors on mixture of sugars. One of these mutants decreased its ability to transport glucose but still transported xylose with even higher affinity kinetics. The successful reprogramming of this transporter to increase its preference for xylose over glucose was used to facilitate efficient co-consumption of hexose and pentose sugars in a novel K. marxianus strain, significantly shortening the time of the whole process.