Analysis of antifungal extract production from plants and in vivo assessment of activity

Abstract

O uso constante e excessivo de fungicidas sintéticos contribui para o aumento da poluição dos solos, das águas, o surgimento de resistência dos fungos alvo bem como possíveis efeitos de toxicidade para a saúde humana. Estas adversidades têm estimulado cada vez mais a procura de novas alternativas mais sustentáveis para o ambiente. Os extratos vegetais normalmente ricos em metabolitos secundários, contêm frequentemente compostos com propriedades antifúngicas. Estes compostos poderão ser alternativas aos fungicidas sintéticos uma vez que não há o risco de acumulação no ambiente e atuam em vários locais do fungo alvo. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antifúngica de várias espécies de plantas: Digitalis purpurea, Eucalyptus globulus, Beta vulgaris e Hedera helix. O extrato aquoso hera foi selecionado devido aos resultados promissores obtidos nos ensaios de viabilidade da levedura Saccharomyces cerevisiae, organismo modelo utilizado. Além disso, foram utilizadas estirpes mutantes de S. cerevisiae para estudar o possível mecanismo de ação do extrato aquoso de Hedera helix. Os ensaios de viabilidade sugerem que, pelo menos um dos alvos é a parede celular. Estes resultados foram reforçados através de ensaios de sensibilidade osmótica, onde foi observada uma menor viabilidade celular em células cultivadas na presença de 50 µg/ml de extrato em meio YPD contendo a maior concentração de NaCl utilizada (0,75 M). O extrato de Hedera helix foi testado contra várias espécies de fungos fitopatogénicos tais como do género Colletotrichum (C. acutatum, C. nymphaeae, C. gloeosporioides, C. godetiae), Diplodia corticola e Phytophthora cinnamomi. Dos fungos utilizados, Diplodia corticola foi o mais suscetível à ação do extrato aquoso de H. helix, com uma inibição de 70 % após 3 dias de incubação. Adicionalmente, foram realizados dois ensaios ex vivo em plantas. Com o ensaio em folhas de morangueiro foi possível verificar um atraso da infeção por C. acutatum e ausência de efeitos fitotóxicos na concentração testada. O ensaio com estacas de sobreiro foi inconclusivo necessitando de otimização do protocolo. Concluindo, o extrato de Hedera helix poderá ser uma fonte para novos fungicidas naturais, nomeadamente contra Diplodia corticola. Considerando que este fungo ameaça os sobreiros, fonte de um material economicamente importante e altamente valorizado, a cortiça, os resultados deste trabalho abrem a possibilidade de uma prevenção das infeções fúngicas de uma forma mais biossustentável e um aumento da produção de cortiça.

The negative impact caused by the constant and excessive use of synthetic fungicides contributes to soil and water pollution, the emergence of resistance of target fungi as well as possible toxicity effects on human health. These adversities have increasingly stimulated the search for new and more sustainable alternatives for the environment. Plant extracts normally rich in secondary metabolites, often contain compounds with antifungal properties. These compounds could be alternatives to synthetic fungicides as they do not accumulate in the environment and act on several sites of the target fungus. With this in background, the main aim of the work was to evaluate the antifungal activity of several plant species: Digitalis purpurea, Eucalyptus globulus, Beta vulgaris and Hedera helix. The ivy aqueous extract was selected because of the promising results obtained in the yeast Saccharomyces cerevisiae (model organism used) viability assays. In addition, mutant strains of S. cerevisiae were used to study the possible mechanism of action of the aqueous extract of Hedera helix. Viability assays suggested that, at least one of the targets is the cell wall. These results were reinforced through osmotic sensitivity assays, where lower cell viability was seen in cells grown in the presence of 50 µg/ ml extract and plated on YPD medium containing the highest NaCl concentration used, 0.75 M. Hedera helix extract was tested against various species of phytopathogenic fungi such as of Colletotrichum genus (C. acutatum, C. nymphaeae, C. gloeosporioides, C. godetiae), Diplodia corticola and Phytophthora cinnamomi. Among the fungi used, Diplodia corticola was the most susceptible to the action of the aqueous extract of H. helix, with an inhibition of 70 % after 3 days of inoculation. Two plant ex vivo assays were conducted. With the strawberry leaves assay it was possible to verify a delay of infection of C. acutatum and absence of phytotoxic effects at the concentration tested. The cork oak cutting assay was inconclusive and needs further protocol optimization. In conclusion, it is believed that ivy extract could be a source for new natural fungicides, namely against Diplodia corticola. Considering that this fungus threatens cork oak stands, the source of an economically important and highly valued material, the cork, the results of this work open the possibility of an environmental-friendlier prevention of fungal infections and the improvement of cork production.