Reprogramming Pseudomonas aeruginosa: an in depth study on phage-host interaction

Abstract

Phages are bacterial viruses with high interest for science and technology due to their applicability in human health, biotechnology, agriculture, and veterinary, as well as in synthetic biology. As therapeutic agents, phages can be used to treat life-threatening bacterial infections, such as Pseudomonas aeruginosa infections, although its approval in human medicine is mainly limited by the lack of knowledge about phage mode of action under in vivo conditions and bacterial responses towards phage infection. In this work, RNA-seq of phage-infected bacteria grown under different media conditions and adhered to human lung epithelium was performed to capture a global view of the transcriptional events that occur under phage therapy. Thus, it was possible to prove that P. aeruginosa was significantly more virulent when cultured in media used to grow human lung epithelial cells, as well as when adhered to a monolayer of human lung epithelium, than when cultured in lysogeny broth. During phage infection, it was observed that global transcriptomes are substantially different at early infection, an important phase during which phage takeover of the bacterial cell occurs, with particular changes in metabolic pathways associated with energy acquisition. Curiously, in all growth conditions, there is a set of common mechanisms that are targeted by the phage, which influence the phage transcriptional landscape. These mechanisms include prophage induction, bacterial receptors shutdown, and motility inhibition. In addition, specific transcriptional events were captured for specific growth conditions, indicating that phage can adapt the bacterial cell to reallocate resources for infection and surpass the limitations imposed by bacterial defences. The results put into evidence the relevance of using complex settings that mimics in vivo conditions to study phage-bacteria interplay, and the obviously phage versatility on bacterial cell invasion under different environments. Besides providing a better understanding on phage/host interactions, transcriptomics did not disclose the phage´s genes that are essential for phage replication. Therefore, a genomic approach based on the direct manipulation of phage´s genome was made to obtain phages with a reduced genome. This approach consists in exposing the phage to a mutagenic agent and heat treatments in the presence of a chelating agent. The surviving phages had large deletions (up to 3kb) in their early genes and revealed similar ability in the killing of the bacterial host. However, major changes occur in terms of the host range and in their long-term competitiveness, which might indicate that early genes are not essential for phage replication in lab conditions but confer competitive advantages to the phage. This approach enables the fast generation of mutants that can provide clues towards a better understanding of the role of unknown genes and potentially drive the discovery of novel phage sequences and phage core infection mechanisms at the molecular level.

Os fagos são vírus que infetam bactérias e que têm elevado interesse devido à sua aplicabilidade nas áreas da saúde humana, biotecnologia, agricultura, veterinária, e biologia sintética. Como agentes terapêuticos, os fagos podem ser usados para tratar infeções provocadas por bactérias resilientes, como P. aeruginosa. Assim, a sua aprovação está sobretudo limitada à falta de conhecimento no modo de ação dos fagos em condições in vivo e nas respostas bacterianas associadas. Neste trabalho foi realizado RNAseq de culturas bacterianas infetadas com fago que cresceram em dois meios distintos, e aderidas a epitélio de pulmão humano, para obter uma visão global dos eventos transcricionais que ocorrem durante a terapia fágica. Assim, foi possível provar que P. aeruginosa encontra-se significantemente mais virulenta quando cultivada em meio de crescimento de células epiteliais, assim como quando aderida a uma monocamada das mesmas, comparativamente em meio “Lysogeny broth”. Durante a infeção do fago, o transcriptoma global é muito diferente na fase inicial da infeção, etapa importante em que o fago faz uma reprogramação da célula bacteriana com alterações em metabolismos associados à produção de energia. Curiosamente, em todas as condições, há um conjunto de mecanismos comuns que são manipulados pelo fago e influenciam o transcriptoma bacteriano. Estes incluem a indução de profago, diminuição da expressão de recetores da superfície bacteriana, e inibição da motilidade. Ainda, eventos transcricionais específicos foram capturados em determinadas condições de crescimento, indicando que o fago adapta a célula bacteriana para realocar recursos essenciais à infeção e ultrapassar as limitações impostas pelas defesas bacterianas. Os resultados põem em evidência a relevância de usar condições complexas que mimetizem as condições in vivo para estudar a interação fago-bactéria, assim como a obvia versatilidade do fago em invadir a célula bacteriana em diferentes condições. Apesar de permitir conhecer a interação fagos/hospedeiro, os dados obtidos não permitiram inferir sobre os genes dos fagos essenciais para a sua replicação. Assim, recorreu-se a uma abordagem genómica para gerar fagos com genomes reduzidos. Esta abordagem consistiu em expor os fagos a um agente mutagénico e um tratamento térmico na presença de agente quelante. Os fagos sobreviventes possuem deleções consideráveis e são eficientes contra a bactéria hospedeira. Contudo, mudanças significativas ocorrem no espectro lítico do fago e na sua capacidade competitiva a longo termo, indicando que os genes iniciais não são essenciais para a replicação do fago em condições laboratoriais, mas conferem vantagens competitivas ao fago. O método permitiu gerar mutantes que providenciem conhecimento sobre o papel de genes de fago desconhecidos, e potencialmente descobrir novas sequências de fago e elucidar mecanismos de infeção do fago a nível molecular.