Study of the homologue of the Machado-Joseph disease gene in Mus musculus

Abstract

Polyglutamine-associated (polyQ) diseases are the most common class of inherited neurodegenerative disorders. These yet untreatable disorders (nine at this moment) are characterised by a selective neuronal death, specific of each disease, and caused by the expansion of a polyQ tract in the corresponding proteins. The pathogenic mechanism underlying these disorders remains to be disclosed. Although a toxic gain-of-function of the expanded polyQ proteins has been proposed as a potential model of pathogenesis, recently another model emerged, proposing a combination of a gain-of-function of the mutant protein with a partial lossof- function of the normal protein. Thus, the knowledge of the normal function of these proteins, and not only the cellular effect of the expanded polyQ proteins, may be important for the development of therapeutic strategies for polyQ disorders. Among these polyQ proteins, the physiological function is only known for four of them. Ataxin-3 (ATX3) is a polyQ protein that, when expanded, leads to Machado-Joseph disease (MJD), which is the most frequent spinocerebellar ataxia worldwide. Even though, in vitro, deubiquitinating (DUB) and deneddylase enzymatic activities have been attributed to ATX3, suggesting a potential role in the ubiquitin-proteasome system (UPS), the physiological role of this protein remains unknown. Our main goal was to get insight into the function of ATX3 using the mouse as a model. During this work, we have performed an extensive exploratory study of both the mouse homologue gene (Mjd) and of its encoded protein, mATX3. We have cloned the Mjd gene, characterised its genomic structure, and performed bioinformatic and functional studies of its 5’ flanking region. The gene structure was shown to be highly similar to its human counterpart in both the number and size of exons and introns. Promoter studies revealed that the Mjd gene is highly activated in P19 muscle-differentiated cells, which was in conformity with the binding of the muscle-specific transcription factor MyoD, verified here, by EMSA. As the human, mATX3 was shown to have a ubiquitous expression pattern being highly expressed in muscle, ciliated cells, and in the spermatozoid flagella. We have also verified that this protein is expressed since the early embryonic developmental stages (E9.5). We have demonstrated that mATX3 displays in vitro activities of: (1) DUB, towards K48 and K63-linked polyubiquitin chains, and towards a monoubiquitinated fluorogenic substrate; and (2) deneddylase of a neddylated fluorogenic substrate. These activities suggest possible roles of mATX3 in protein degradation through the UPS, but also in the regulation of other cellular processes, such as regulation of the subcellular localisation of proteins, endocytosis, protein trafficking, and DNA repair. Using the yeast two-hybrid system (y2h) we have identified 81 putative protein interactors of mATX3, presenting different subcellular localisations, in agreement with the widely distributed subcellular pattern of mATX3 here described in skeletal muscle, pontine nuclei and seminiferous tubules, using immunoelectron microscopy. Among these interactors, we have cloned and confirmed the interaction of 18 new proteins with mATX3, using additional/complementary y2h assays. These novel mATX3 interactions pointed to possible roles of mATX3 in transcription regulation, protein synthesis and degradation, cell cycle, cellular proliferation, differentiation and motility. Several data obtained in these descriptive studies led us to explore some hypotheses for the potential physiological role(s) of mATX3, particularly in the skeletal muscle. We have found that the Mjd gene, potentially regulated by Foxo transcription factors, is a stress-response gene being upregulated in the skeletal muscle of starved or cold-exposed mice. These results might suggest a potential role of mATX3 in the regulation of protein synthesis and/or degradation in the stress-response, which should be further confirmed in the future. Interestingly, we have also found here that mATX3 might be regulating the activity of the SCF complex, an E3 ubiquitin ligase involved in the UPS, through the interaction with Cul1 and Nedd8. Structural sarcomeric components, such as myosin and actin are degraded through the UPS. In fact, we have demonstrated, using y2h assays, that mATX3 interacts with four sarcomeric proteins (Tnni1, Tnni2, Acta1, and Myh2), which, in turn, might be possible substrates of the enzymatic activities of mATX3 leading to the regulation of these protein amount, stability, and assembly (in the particular case of myosin). These preliminary results indicate a putative physiological role of mATX3 in muscle structure maintenance that must be further explored. Finally, we have demonstrated that mATX3 is important for muscle differentiation using siRNA assays in C2C12 cells, thus showing the first ever described phenotype of cells lacking mATX3. These cells revealed to be misaligned, continue to proliferate, and present a delay in myogenic differentiation, which seem to be due to a deregulation of the integrin signaling pathway, namely through the down-regulation of α5 and α7 integrin subunits. In particular, we have shown that the α5 integrin subunit, degraded by the UPS, might be a substrate of mATX3 DUB activity in its rescue from proteasomal degradation, given that these two proteins interact in GST pull-down assays. Additionally, proteomic studies of these C2C12 cells revealed that absence of mATX3 might be affecting the following integrin signaling transduction-associated processes: cytoskeleton assembly, transcription repression, protein synthesis/degradation, and cell cycle. Data obtained with this work should contribute to an advance in the knowledge of the normal function of ATX3, which might be disrupted in the MJD context, and might also be important in the unveiling of the function of other basal cellular mechanisms.

As doenças de poliglutaminas (poliQ) constituem o grupo mais comum de doenças neurodegenerativas hereditárias. Estas doenças incuráveis (actualmente nove) são caracterizadas por perda neuronal selectiva, específica de cada doença, e causadas por uma expansão de um segmento poliQ nas proteínas correspondentes. O mecanismo patogénico destas doenças continua desconhecido. Apesar de ter sido proposto como modelo de patogénese um ganho de função tóxica das proteínas expandidas, recentemente surgiu outro modelo, propondo uma combinação do ganho de função das proteínas mutadas com uma perda de função das proteínas normais. Deste modo, o conhecimento da função normal destas proteínas, e não só do efeito celular das proteínas poliQ expandidas, pode ser importante para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para as doenças de poliQ. Entre estas proteínas, a função fisiológica só é conhecida para quatro delas. A ataxina-3 (ATX3) é uma proteína poliQ que, quando expandida, leva à doença de Machado-Joseph (MJD), que é a ataxia espinocerebelosa mais frequente em todo o mundo. Apesar de terem sido atribuídas à ATX3, in vitro, as actividades enzimáticas de desubiquitinase (DUB) e desnedilase sugerindo uma possível função no sistema ubiquitinaproteassoma (UPS), a função fisiológica desta proteína continua desconhecida. O nosso objectivo principal foi contribuir para o conhecimento da função da ATX3 usando o ratinho como modelo. Neste trabalho, realizamos um extenso estudo exploratório do gene homólogo em ratinho (Mjd) e da sua codificada proteína, mATX3. Nós clonamos o gene Mjd, caracterizamos a sua estrutura genómica e efectuamos estudos bioinformáticos e funcionais da sua região 5’ flanqueante. A estrutura do gene é muito semelhante à do seu correspondente humano tanto no número como no tamanho de exões e intrões. Os estudos do promotor mostraram que o gene Mjd era altamente activado em células P19 diferenciadas em músculo, o que está de acordo com a verificação, por EMSA, da ligação do factor de transcrição específico de músculo MyoD. Tal como a ATX3 humana, a mATX3 revelou um padrão de expressão ubíquo sendo altamente expressa no músculo, células ciliadas e nos flagelos dos espermatozóides. Verificamos também que esta proteína é expressa desde os primeiros estádios de desenvolvimento embrionário (E9.5). Demonstramos que a mATX3 apresenta actividades in vitro de: (1) DUB, de cadeias poliubiquitinadas K48 e K63-ligadas, e de um substrato fluorogénico monoubiquitinado; e (2) desnedilase, de um substrato fluorogénico nedilado. Estas actividades sugerem possíveis papéis da mATX3 na degradação proteica através do UPS mas também na regulação de outros processos celulares tais como, a regulação da localização subcelular de proteínas, endocitose, tráfego proteico, e reparação de DNA. Usando o sistema de yeast two-hybrid (y2h), identificámos prováveis interactores proteicos da mATX3, apresentando diferentes localizações subcelulares, de acordo com o padrão de distribuição subcelular da mATX3, aqui descrito, no músculo esquelético, núcleos pônticos e tubos seminíforos, usando imunomicroscopia electrónica. Entre estes interactores, clonamos e confirmamos a interacção de 18 novas proteínas com a mATX3, usando ensaios adicionais/ complementares de y2h. Estas novas interacções apontam para possíveis funções da mATX3 na regulação da transcrição, síntese e degradação proteica, ciclo celular, e proliferação, diferenciação e motilidade celular. Os resultados obtidos nestes estudos descritivos levaram-nos a explorar algumas hipóteses para as potenciais funções fisiológicas da mATX3, em particular no músculo esquelético. Verificamos que o gene Mjd, provavelmente regulado pelos factores de transcrição Foxo, é um gene de resposta ao stress estando aumentado no músculo esquelético de ratinhos em jejum ou expostos ao frio. Estes resultados poderão sugerir uma possível função da mATX3 na regulação da síntese e/ou degradação proteica na resposta ao stress, que deverá ser explorada em detalhe no futuro. Neste trabalho, demonstramos que a mATX3 pode estar a regular a actividade do complexo SCF, uma E3 ubiquitina ligase envolvida no UPS, através da sua interacção com a Cul1 e Nedd8. Componentes sarcoméricos estruturais, como a miosina e a actina, são degradados através do UPS. De facto, demonstramos, usando ensaios de y2h, que a mATX3 interactua com quatro proteínas sarcoméricas (Tnni1, Tnni2, Acta1, e Myh2), que, por sua vez, poderão ser possíveis substratos das actividades enzimáticas da mATX3 levando à regulação da quantidade, estabilidade, e organização (em particular da miosina) destas proteínas. Estes resultados preliminares indicam uma potencial função fisiológica da mATX3 na manutenção estrutural do músculo esquelético que deverá ser confirmada no futuro. Finalmente, verificamos que a mATX3 é importante para a diferenciação muscular usando ensaios de siRNA em células C2C12, mostrando o primeiro fenótipo observado para células sem mATX3. Estas células mostraram-se desalinhadas, continuando a proliferar e apresentando um atraso na diferenciação miogénica, o que parece ser a uma desregulação da via de sinalização das integrinas, nomeadamente pelo decréscimo das subunidades α5 e α7 das integrinas. Em particular, demonstrámos que a subunidade α5 da integrina, degradada pelo UPS, poderá ser um substrato da actividade de DUB da mATX3 no impedimento da sua degradação proteassomal, dado que estas duas proteínas interactuam em ensaios de GST pulldown. Adicionalmente, estudos de proteómica destas células sem mATX3 mostraram que a ausência desta proteína poderá estar a afectar os seguintes processos celulares associados com a via de transdução das integrinas: organização do citosqueleto, repressão da transcrição, síntese/degradação proteica e ciclo celular. Os resultados obtidos neste trabalho contribuirão para o avanço do conhecimento da função normal da ATX3, que poderá estar afectada no contexto da MJD, e pode também ser importante para a descoberta de outros mecanismos celulares basais.