Biofunctionality and immunocompatibility of starch-based biomaterials

Abstract

A procura de novos biomateriais que desempenhem funções específicas sem, no entanto, desencadearem respostas negativas nos hospedeiros constitui um desafio permanente e actual nesta área. Biomateriais degradáveis foram uma das soluções propostas e actualmente em aplicação mas, embora possuam vantagens inegáveis, também apresentam alguns problemas nomeadamente no que diz respeito aos seus produtos de degradação e respectivos efeitos negativos consequentes. Outros biomateriais, entre os quais polímeros de origem natural, foram propostos considerando que os seus produtos de degradação poderão ser incorporados nas vias metabólicas normais evitando efeitos secundários no hospedeiro. Até ao momento, e apesar de todos os esforços e do grande número de dispositivos biomédicos desenvolvidos, o biomaterial ideal para uma aplicação específica ainda não foi encontrado. Estudos com polímeros biodegradáveis à base de amido demonstraram que estes materiais possuem propriedades promissoras abrindo novas perspectivas para a sua possível aplicação numa variedade de aplicações biomédicas. Assim, de modo a demonstrar que estes materiais têm de facto potencial para serem utilizados em, por exemplo, substituição óssea, sistemas de libertação controlada, cimentos ósseos e engenharia de tecidos, seria imperativo avaliar com maior profundidade a resposta biológica desencadeada pelos mesmos. Para tal foi delineado um plano de trabalhos com três objectivos principais: i) avaliar a citocompatibilidade dos polímeros e compósitos à base de amido com monitorização da citotoxicidade e análise da adesão e proliferação celulares nas suas superfícies. Foi dada particular atenção a osteoblastos considerando uma possível aplicação ortopédica para estes materiais; ii) estabelecer modelos in vitro para analisar e prever, tanto quanto possível, uma situação real de resposta inflamatória; iii) validar os resultados in vitro com um modelo in vivo já estabelecido em outros trabalhos de análise da resposta inflamatória a biomateriais. Foram estudadas misturas de amido de milho com três componentes sintéticos (álcool etileno vinílico, acetato de celulose e policaprolactona) assim como os respectivos compósitos com percentagens crescentes de um cerâmico bioactivo (hidroxiapatite). Numa primeira fase de avaliação do efeito dos produtos de degradação dos materiais em estudo foi concluído que duas das misturas apresentam baixa toxicidade, mesmo inferior à determinada para o biomaterial biodegradável padrão Poly-L-Lactic Acid (PLLA). No entanto, os testes de adesão celular revelaram que, para além dos produtos de degradação, as propriedades das superfícies podem determinar se um material possui ou não as características apropriadas para a melhor resposta celular. O efeito da incorporação de HA nos materiais à base de amido foi também analisado concluindo-se que a presença deste cerâmico não induz, de um modo geral, um efeito significativo no desempenho celular de células do tipo osteoblastos. A avaliação in vitro da imunocompatibilidade dos polímeros e compósitos à base de amido foi efectuada numa segunda fase. Esta centrou-se essencialmente na identificação de variações na produção de radicais livres e enzimas degradativas por neutrófilos assim como na capacidade desses materiais activarem, in vitro, outras células do sistema imune. Na presença de alguns materiais, os neutrófilos foram estimulados a níveis muito inferiores ao seu potencial máximo enquanto que na presença de outros materiais as espécies reactivas de oxigénio produzidas pelos neutrófilos activados e que provocam lesões tecidulares, foram inactivadas por “scavangers” presentes nos materiais à base de amido. Verificou-se ainda que algumas citoquinas específicas não foram produzidas na presença de alguns dos materiais estudados enquanto que outras não foram mesmo segregadas em nenhuma das condições. A incorporação de hidroxiapatite nos polímeros à base de amido não afectou significativamente a activação das células do sistema imune ou resultou, dependendo da mistura em causa, numa menor activação. De um modo geral, a avaliação da imunocompatibilidade in vitro permitiu concluir que os polímeros e compósitos à base de amido têm um fraco potential para desencader uma resposta inflamatória. Após implantação in vivo, estes resultados puderam ser confirmados validando os modelos experimentais estabelecidos in vitro. Macroscopicamente não foram observados sinais de uma reacção inflamatória considerável. O facto de não se ter formado qualquer exsudado celular, de os materiais terem sido encapsulados por uma cápsula fibrosa fina e da amplitude da resposta nos tecidos não ter sido muito forte para a maioria dos materiais em estudo, permitiu afirmar que os polímeros e compósitos à base de amido não induzem uma resposta inflamatória severa para os tempos de implantação estudados. Em resumo, os estudos de citocompatibilidade e imunocompatibilidade demonstraram que os polímeros e compósitos à base de milho são biomateriais promissores. Em comparação com os biomateriais degradáveis actualmente em uso, possuem propriedades capazes de induzir um comportamento semelhante, ou mesmo melhor, em termos de citotoxicidade. Estes dados foram reconfirmados com a adesão e proliferação de células do tipo osteoblastos na superfície de alguns dos materiais à base de amido, que demonstraram ser comparáveis às observadas no PLLA, evidenciando a possibilidade de usar esses materiais em aplicações ortopédicas. As conclusões retiradas dos estudos in vitro e in vivo de imunocompatibilidade reforçam as observações das experiências de citocompatibilidade e em conjunto, evidenciam a possibilidade de utilização dos biomateriais à base de amido, com fraca capacidade de desencadear uma reacção inflamatória, em aplicações biomédicas.

There is an increasing demand for the development of new biomaterials that perform their function without eliciting negative effects in the host. Biodegradable biomaterials have arisen as the solution for some problems which currently involve traditional devices. However, and not neglecting the advantages of the degradable systems, some drawbacks have been found especially in terms of deleterious effects originated from their degradation products. Therefore, natural origin polymers are emerging within the biomaterials field. The rationale is that the incorporation of their degradation products into normal metabolic pathways will avoid secondary effects in the host. So far, and although there are many biodegradable biomedical devices being used, the ideal biomaterial for a specific application is yet to be discovered. Studies with biodegradable starch-based polymers have demonstrated that these biomaterials possess a range of properties which make them suitable for different biomedical applications. Thus, to gain further inside in the suitability of these natural origin biomaterials for different biomedical applications such as bone replacement, drug delivery systems, bone cements and tissue engineering scaffolding, we considered that it was imperative to further assess the biological response provoked by them. For that the PhD work plan that culminated in this thesis was delineated having in mind three main goals: i) to assess the cytocompatibility of the starch-based polymers and composites by means of screening the cytotoxicity and evaluating cell adhesion and proliferation behaviour on their surfaces, particularly osteoblasts since we pursue a potential orthopaedic application for these materials; ii) to establish in vitro models to analyse and to try to predict, as much as possible, the real in vivo situation in terms of host response, thus to evaluate immunocompatibility of the materials; iii) to validate the in vitro results with an in vivo model previously used to study host response. Blends of corn starch with three different synthetic components (ethylene vinyl alcohol, cellulose acetate and polycaprolactone) and their respective hydroxyapatite (HA) reinforced composites with increasing percentages of HA ceramic were studied. The short-term effects of the degradation products was analysed and it was possible to observe that two of the studied blends possess a low degree of toxicity, being even better than the gold standard biodegradable biomaterial. Nonetheless, cell adhesion tests revealed that surface properties can determine if a material has the appropriated characteristics for the best cellular behaviour. Generally, the reinforcement of the polymers with hydroxyapatite did not induce a significant effect in terms of improvement of osteoblast-like cells performance with the studied conditions. The in vitro evaluation of the immunocompatibility of starch-based polymers and composites was focused on changes in the free radical and degranulation activity of neutrophils as well as on their potential not stimulated to their potential maximum and in other situations scavengers of the reactive oxygen species, which are known to provoke tissue damage, produced by activated neutrophils reduced their negative action. In addition, specific pro-inflammatory cytokines were not produced in the presence of some of the studied materials while others were even undetectable under any of the stipulated conditions. In terms of inflammatory reaction, the presence of hydroxyapatite either did not induce a significant effect or resulted in low cell activation. Thus, the in vitro results allow for concluding that starch-based polymers and composites possess a weak potential to break out an inflammatory response. After in vivo implantation no macroscopic signs of a considerable inflammatory reaction in any of the animals were observed, no cellular exudate was formed and a thin fibrous capsule surrounded all implants. Although there were some materials that stimulated stronger tissue responses, generally biodegradable starch-based biomaterials did not induce a severe reaction for the studied implantation times. The in vitro results were therefore confirmed by these in vivo observations which validate the established in vitro models. In general, the cytocompatibility and immunocompatibility studies showed that starch-based polymers and composites are promising biomaterials. Comparatively to the currently used biodegradables, they possess properties that induce similar to better cytotoxicity behaviour. The adhesion and proliferation of osteoblast-like cells on some of these materials was also comparable to that of PLLA which demonstrates their potential to be used in orthopaedic applications. The in vitro and in vivo immunocompatibility remarks further support the suitability of starch-based biomaterials to be used in biomedical applications due to their weak potential to break out an inflammatory reaction.