Elucidation of molecular pathways involved in Saccharomyces cerevisiae apoptotic cell death

Abstract

The yeast Saccharomyces cerevisiae undergoes apoptosis upon either external or physiological stimuli, through the intervention of several orthologues of mammalian apoptotic regulators. Evidence indicated that like mammalian cells, yeast present distinct pathways that lead to an apoptotic cell death. However, integrative studies allowing the definition of key pathways in yeast apoptosis were still scarce at the moment this work began. Such studies are crucial for increasing the knowledge on the intrinsic yeast apoptotic mechanisms, allowing a better understanding of the roots of metazoan apoptosis. Using proteomic, biochemistry and functional analysis, data was obtained contributing to a further understanding of the apoptotic pathways induced by three well described apoptotic inducers, acetic acid, hydrogen peroxide (H2O2) and chronological aging. We revealed that contrarily to H2O2-induced apoptosis, acetic acid promotes intracellular amino acids starvation, and induces alterations in the levels of proteins directly or indirectly linked with the target of rapamycin (TOR) pathway, implicating this pathway in the progress of apoptosis. Further analysis demonstrated that the role of TOR pathway in acetic acid-induced apoptosis requires the downstream phosphatases Pph21p, Pph22p, but not Sit4p. We also demonstrated that general amino-acid control (GAAC) system, through its main players Gcn2p and Gcn4p, cooperates with TOR in the triggering of yeast apoptosis. The translation factor eEF1A appeared as a key factor on acetic acid-induced apoptotic mechanism, suggesting a role on the promotion of actin cytoskeleton alterations and mitochondrial dysfunction that culminate in cell death. Analysis of yeast H2O2-induced apoptotic process revealed the induction of a totally distinct mechanism. Upon H2O2 treatment, we demonstrated that yeast cells are able to synthesize the signaling molecule nitric oxide (NO), which in turn acts in two different ways: it boosts the intracellular levels of reactive oxygen species (ROS), and promotes, as in mammalian cells, S-nitrosation of the yeast glycolytic enzyme glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH). Additionally, we demonstrated that these molecular events also occur during the physiological triggering of apoptosis during chronological aging. By further analyzing the role of GAPDH in the commitment of yeast cells to apoptosis, we revealed that this protein is, at the present date, the only described yeast metacaspase substrate, being cleaved upon NO signaling. NO control of metacaspase-mediated GAPDH cleavage might rely on its capacity to activate yeast metacaspase or in the promotion of GAPDH S-nitrosation as a signal for cleavage. Preliminary results indicate that GAPDH is cleaved by metacaspase in order to impair its role in survival through participation in autophagy. Since yeast cells display an endogenous apoptotic machinery, besides contributing for the elucidation of metazoan apoptosis, yeast also offers the opportunity for screening compounds with antifungal properties. In fact, the discovery of antifungal compounds able to promote cell death on antifungal-resistant fungi could be one of the major contributions of yeast for biomedical research. Thus, ciclopirox olamine (CPO), a fungicidal agent widely used in clinical practice but which mechanism of action was still elusive, was shown to induce in yeast cells a programmed cell death (PCD) process, characterized by nuclear morphology alterations, chromatin condensation associated with the appearance of a population in the sub-G0/G1 cell cycle phase and an arrest in the G2/M phases. Subsequent analysis on CPO-mediated cell death indicated that the PCD process induced by this antifungal agent is atypical, as it was neither associated with ROS signaling nor with a terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)-positive phenotype, or with the yeast homologue of apoptosis-inducing factor (AIF) and metacaspase. On the contrary, CPO effects seem to be dependent on unknown aspartic protease activity, indicating that CPO could also be employed for the further uncovering of yeast endogenous cell death machinery. In summary, the results presented in the scope of this thesis contributed to the knowledge on the yeast apoptotic processes, reinforcing yeast as an extremely valuable model for the study of metazoan apoptosis and for the screening of effective antifungal compounds able to modulate its endogenous apoptotic machinery.

A levedura Saccharomyces cerevisiae apresenta um mecanismo de morte celular programada com um fenótipo apoptótico, desencadeado por diferentes estímulos, quer externos, quer fisiológicos. Este processo é mediado por inúmeros reguladores apoptóticos, ortólogos aos existentes em mamíferos. Evidências anteriores indicam que as leveduras, tal como as células de mamífero, possuem diferentes vias de indução de morte apoptótica. No entanto são ainda muito limitados os estudos integradores demonstrando a existência de vias apoptóticas distintas e definidas. Tais estudos revestem-se de grande importância pois permitirão um melhor conhecimento sobre as origens do processo de morte apoptótica nos metazoa. Neste sentido, através de estudos proteómicos, bioquímicos e funcionais, apresentados no contexto desta tese, foi possível contribuir para uma melhor definição das vias apoptóticas existentes na levedura, após indução de morte por três estímulos bem caracterizados, ácido acético, peróxido de hidrogénio (H2O2), e envelhecimento cronológico. Verificámos que, contrariamente à morte apoptótica induzida por H2O2, o ácido acético actua nas leveduras promovendo uma depleção intracelular de aminoácidos, provocando alterações na expressão de proteínas directa ou indirectamente relacionadas com a via “target of rapamycin” (TOR), implicando esta via na progressão da morte apoptótica. Análises adicionais demonstraram que o papel da via TOR na morte apoptótica da levedura após indução com ácido acético envolve a actuação a jusante das fosfatases Pph21p,Pph22p, mas não Sit4p. Demonstrámos também que o sistema geral de controlo de aminoácidos (GAAC system), através dos seus principais intervenientes, Gcn2p e Gcn4p, coopera com a via TOR para o desenrolar da morte apoptótica induzida por ácido acético. Para além disso, o factor de tradução eEF1A aparece como estando relacionado com o processo de morte apoptótica induzida por ácido acético, através da promoção de alterações no citoesqueleto de actina e possivelmente disfunções mitocôndriais. Por outro lado, a análise do processo apoptótico induzido por H2O2 revelou a activação de um mecanismo completamente distinto. O tratamento com H2O2 promove a síntese de óxido nítrico (NO) nas leveduras, que por seu lado actua em dois sentidos: provocando uma amplificação dos níveis intracelulares de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e promovendo, à semelhança do que ocorre em células eucarióticas superiores, a S-nitrosação da enzima glicolítica gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Estes eventos moleculares também ocorrem durante o envelhecimento cronológico da levedura, ou seja, após um estímulo apoptótico fisiológico. A análise posterior da relevância fisiológica da GAPDH para o processo apoptótico, permitiu concluir que esta proteína é, até à presente data, o único substrato conhecido da metacaspase da levedura, sendo clivada após sinalização pelo NO. A acção do NO no controlo da clivagem da GAPDH mediada pela metacaspase poderá estar relacionada com a capacidade do NO em activar a metacaspase ou com a promoção da S-nitrosação da GAPDH como um sinal de clivagem. Resultados preliminares indicaram ainda que a clivagem da GAPDH pela metacaspase parece inibir o seu papel protector de sobrevivência na promoção de autofagia, desencadeando a morte celular. Uma vez que as leveduras possuem uma maquinaria endógena de morte apoptótica, para além de poderem contribuir para a elucidação do processo apoptótico dos metazoa, oferecem ainda a oportunidade de serem usadas em “screenings” de compostos cuja actividade antifúngica resida na activação da maquinaria apoptótica da levedura. Esta poderá ser de facto, uma das maiores contribuições deste microrganismo para a investigação biomédica. Neste sentido, foi possível demonstrar que o agente fungicida ciclopirox olamine (CPO), amplamente usado na prática clínica mas cujo mecanismo de acção não era totalmente conhecido, induz na levedura um processo de morte celular programada, caracterizado por alterações morfológicas nucleares, condensação da cromatina associada à presença de uma população celular na fase sub-G0/G1 do ciclo celular e a uma paragem do ciclo na fase G2/M. Análises posteriores demonstraram que o processo de morte celular programada induzido por este antifúngico correspondia a um processo atípico pois não estava nem associado à sinalização via ROS, metacaspase ou factor de indução de apoptose (AIF), nem com um fenótipo TUNEL positivo. Pelo contrário, o seu efeito parece depender de proteases aspárticas desconhecidas, indicando que o CPO poderá também ser usado em investigações futuras para a descoberta de novos reguladores da maquinaria de morte endógena da levedura. Em resumo, os resultados aqui apresentados permitiram o aumento do conhecimento dos processos apoptóticos da levedura, reforçando o seu uso como um modelo extremamente valioso no estudo da morte apoptótica de metazoa, e no “screening” de composto antifúngicos capazes de modular a sua maquinaria apoptótica endógena.