Expressão e localização subcelular de aquaporinas SIP de Vitis vinifera e Olea europaea

Abstract

A existência de uma membrana biológica permeável à água foi proposta há mais de 100 anos antes de ser descoberta a sua estrutura básica. Contudo, a velocidade reduzida da difusão simples da água através da bicamada lipídica sugeriu a existência de uma via adicional mediada, um factor proteico cuja expressão pode variar nos diferentes tipos de células. A descoberta das aquaporinas como canais que aumentam 10 a 100 vezes a permeabilidade da membrana à água é relativamente recente e conduziu à atribuição do prémio Nobel da Química a Peter Agre em 2003 "for discoveries concerning channels in cell membranes". As aquaporinas pertencem à família de proteínas MIP (major intrinsic protein) e encontram-se presentes em todas as formas de vida. Nas plantas as aquaporinas são agrupadas em 4 sub-famílias, PIPs (plasma membrane intrinsic proteins), TIPs (tonoplast intrinsic proteins), NIPs (nodulin26-like intrinsic proteins) e SIPs (small and basic intrinsic proteins). Mais recentemente, as SIPs e as aquaporinas de mamíferos AQP11 e AQP12, foram reclassificadas como membros de uma nova super-família de aquaporinas intracelulares; no entanto a maioria dos critérios ainda se baseiam na análise da estrutura primária das proteínas devido à escassez de informação sobre a sua localização e função. O presente trabalho incluiu um estudo in silico de sequências aminoacídicas de proteínas SIP de videira e oliveira identificadas e clonadas no seio do nosso grupo de investigação, bem como de sequências aminoacídicas disponíveis nas bases de dados de SIPs de Arabidopsis e do milho e das aquaporinas de mamífero AQP11 e AQP12. Os resultados obtidos permitiram comparar as proteínas, que partilham algumas semelhanças ao nível de sequências aminoacídicas específicas, e discutir os critérios da sua inclusão numa super-família de aquaporinas intracelulares. Em particular foi investigada a presença do sinal de miristoilação (sp) na extremidade Nterminal das proteínas, cuja função pode estar relacionada com o seu direccionamento e em mecanismos de transdução de sinal. Este péptido sinal foi identificado unicamente nas SIP1 da oliveira (OeSIP1;1 e OeSIP1;2), videira (VvSIP1) e numa SIP1 do milho (ZmSIP1;1). O trabalho experimental contemplou ainda o estudo da localização subcelular das aquaporinas VvSIP1 e OeSIP1;1, bem como a funcionalidade da sequência sinal de N-miristoilação. Com efeito, estudos prévios desenvolvidos no nosso grupo mostraram que a expressão em ovócitos das aquaporinas VvSIP1 e VvSIP1-sp não aumentou a permeabilidade à água, sugerindo que estas não são direccionadas para a membrana plasmática e/ou não são canais de água eficientes. As aquaporinas VvSIP1 e OeSIP1;1, assim como as construções VvSIP1-sp e OeSIP1;1-sp cujo sinal de N-miristoilação foi removido, foram fundidas com a proteína fluorescente GFP e expressas em 2 sistemas heterólogos distintos, ovócitos de Xenopus e levedura. A observação das preparações ao microscópio de fluorescência sugeriu que as aquaporinas VvSIP1 e OeSIP1.1 são direccionadas para a membrana plasmática nos ovócitos de Xenopus e para o retículo endoplasmático no modelo de levedura. Em Saccharomyces cerevisiae não se observaram diferenças significativas nos sinais de fluorescência quando as sequências sp foram removidas das proteínas VvSIP1 e OeSIP1;1, ao contrário dos resultados obtidos no modelo de Xenopus, sugerindo que o péptido sinal não afecta o direccionamento das aquaporinas SIP em leveduras. Os resultados contraditórios obtidos com os 2 modelos de expressão são comparados e discutidos com a informação escassa e recente disponível na literatura relativamente à localização e função das aquaporinas SIP.

The existence of a biological membrane permeable to water was proposed more than one hundred years ago, even before the discovery of its basic structure. However, the reduced rate of water transport by simple diffusion through the lipid bilayer suggested the existence of an additional path for water trafficking, mediated by a protein differently expressed in several cell types. The discovery of aquaporins as channels increasing 10 to 100-fold the water membrane permeability is relatively recent and was awarded with the Nobel Price in Chemistry to Peter Agre in 2003 “for discoveries concerning channels in cell membranes”. The aquaporins belong to the MIP (major intrinsic protein) proteins family and are widespread in nature. In plants, aquaporins are grouped in four sub-families, PIPs (plasma membrane intrinsic proteins), TIPs (tonoplast intrinsic proteins), NIPs (nodulin26-like intrinsic proteins) and SIPs (small and basic intrinsic proteins). More recently, both SIPs and the mammal aquaporins AQP11 and AQP12 were reclassified as members of a new super-family of subcellular aquaporins, regardless of the majority of classification criteria still being based on the analysis of the proteins primary structure due to the lack of information about its cellular localization and function. The present study includes an in silico analysis of the aminoacidic sequences of SIPs from grape (Vitis vinifera) and olive tree (Olea europaea), two of which have been identified and cloned in our laboratory (VvSIP1 e OeSIP1;1), as well as the sequences available in the database from Arabidopsis and maize SIPs, and the mammal aquaporins AQP11 and AQP12. Results showed that the proteins share some similarities at the level of the specific aminoacidic sequences and allowed us to discuss the criteria of their inclusion in a new super-family of subcellular aquaporins. Particularly, the presence of a myristoylation signal (sp) in the proteins N-termini extremity, whose function could be related to its membrane targeting and signal transduction, was investigated. This signal peptide was only identified in SIP1 proteins from olive (OeSIP1;1 and OeSIP1;2), grapevine (VvSIP1) and in one SIP1 from maize (ZmSIP1;1). The study of the subcellular location of VvSIP1 and OeSIP1;1 aquaporins cloned in our laboratory, as well as the functionality of the Nmyristoylation signal sequence, is also included in the present thesis. Previous studies developed in our group showed that the expression in oocytes of VvSIP1 and VvSIP1-sp aquaporins did not increase water permeability, suggesting they are not targeted to the plasma membrane and/or they are not efficient water channels. VvSIP1 and OeSIP1;1 aquaporins, as well as the VvSIP1-sp and OeSIP1;1-sp constructions, which N-myristoylation signal had been removed, were fused with the fluorescent protein GFP and expressed in two distinct heterologous systems, Xenopus oocytes and yeast. Observation under a fluorescence microscope showed that VvSIP1 and OeSIP1.1 aquaporins are targeted to the plasma membrane in the Xenopus oocytes and to the endoplasmic reticulum in the yeast. Contrarily to the results obtained in the Xenopus model, in Saccharomyces cerevisiae no significant differences in the fluorescent signals were observed when the sp sequences were removed from the VvSIP1 and OeSIP1;1 proteins, suggesting that the signal peptide does not affect the targeting of SIP aquaporins in yeast. The differing results obtained with the two expression models are compared and discussed with the recent and scarce information available in the literature about the localization and function of the SIP aquaporins.