Photonic Nearfield effects applied to real-time biosensing super resolution bioimaging

Abstract

O campo de estudos da cinética e hibridação do ADN é dominada por modelos e previsões teóricas e semi-empíricas orientadas para situações gerais e de observações em massa. Em muitos casos estes modelos são aplicáveis num contexto de biodeteção como é o caso do sensor de ADN em forma de gancho cujo sinal ótico é produzido em resposta a fases de desdobramento causadas por hibridação com um analito nucleótido complementar. Neste trabalho, desenvolvemos uma plataforma de biosensor avançada através da deposição de uma monocamada de grafeno que é depois funcionalizada com sensores de ADN em forma de gancho, que, por sua vez, estão ligados a um repórter fluorescente. Devido a interações “nearfield” com o grafeno, a fluorescência do repórter é diminuída conforme a sua proximidade à camada. Esta distância axial muda ao longo do tempo com base nos processos de hibridação com o analito. Ferramentas óticas de TIRF acopladas a uma camara sensível EM-CCD foram usadas para detetar estas flutuações de sinais num regime de deteção singular molecular. Estes sinais esporádicos permitiram a determinação da PSF do sistema ótico e consequente reconstrução de super resolução das imagens. A combinação destas técnicas óticas permitiu a extração do sinal fluorescente de moléculas individuais e consequente informação do mecanismo cinético do sensor, cujos tempos de desdobramento duraram 7s. Fenómenos cinéticos que levaram a fases intermédias da forma em gancho também foram identificadoss e causaram o dobro do tempo de desdobramento. Conversão do sinal fluorescente em distâncias fluoróforo-grafeno com base num modelo semi empírico mostraram a uma resolução nanométrica que o processo de desdobramento tem caraterísticas em escada com fases ativas e estáticas no processo cinético, que, em alguns casos podem ser atribuídos a fenómenos de nucleação. A plataforma de biodeteção e métodos óticos associados podem ser usado em trabalhos futuros que visam avaliar a cinética de moléculas de ADN em diferentes condições.

The field of studies of DNA kinetics and hybridization is dominated by ensemble predictions based on semi-empirical or theoretical models. These insights are often employed in the context of fluorescent biosensing assays such as the case of the DNA hairpin probe whose optical signal is produced as a result of an unfolding kinetic phase due to hybridization with a complementary target analyte strand. In this work we develop an advanced biosensing platform fabricated by deposition of a single layer of graphene which is then functionalized with fluorophore labelled DNA hairpin probes. Because of the nearfield photonic effects of graphene that produce a distance dependent quenching effect on the fluorescent label, axial displacements of the fluorophore as a result of hybridization produce different optical signals. A widefield TIRF optical setting with a sensitive EM-CCD camera was employed to detect these signal fluctuations in a single molecule regime environment of low concentrations. These sparce fluorescent signals were used in the determination of the PSF of the optical setup in a novel approach to super resolution reconstruction. The combination of these techniques allowed for single molecule fluorescence detection and consequent kinetic assessment of individual hairpins, whose unfolding times were estimated to be around the 7s. Kinetic phenomena resulting in intermediate partially hybridized states were also identified and estimated to double the time required for unfolding of the hairpin probes. Conversion of the fluorescent signal into distances of fluorophore-graphene by a semi-empirical model showed at a nanometre resolution that the unfolding process is a step-like phenomena of intermittent metastates of unfolding and static periods which can be in some cases attributed to nucleation events. The developed biosensing platform and associated optical methods can be adopted for further research into the kinetics of DNA molecules under different environmental conditions.