Obtenção e caracterização de linhas celulares de BY-2 a expressar cardosinas

Abstract

A cardosina A e a cardosina B são proteinases aspárticas isoladas a partir de flores de Cynara cardunculus. Apesar da sua grande identidade, apresentam uma localização diferencial em flores de cardo, sendo a cardosina A acumulada no vacúolo e a cardosina B secretada. Por este mesmo motivo, estas proteinases foram consideradas um bom modelo para o estudo do trânsito intracelular de APs em plantas. A expressão heteróloga destas proteínas em Nicotiana tabacum conduz ao endereçamento de ambas as cardosinas para o vacúolo, tornando-se o tabaco um modelo biológico de interesse para responder a diferentes questões sobre o trânsito intracelular destas proteínas para o vacúolo. Até à data, estudos realizados em tabaco não conseguiram esclarecer acerca da via, ou vias de trânsito, envolvidas no endereçamento das cardosinas para o vacúolo. As células Bright Yellow-2 (BY-2) constituem uma linha celular de tabaco apresentando diversas vantagens em relação às células da planta de tabaco. Neste trabalho foram utilizadas células BY-2 de modo a introduzir um novo modelo biológico de estudo do trânsito das cardosinas até o vacúolo, permitindo, ao mesmo tempo, a comparação do seu trânsito entre o sistema planta e células em cultura. Foi obtida uma construção viável de cardosina A com a proteína fluorescente mCherry, separadas por um linker, construção que poderá ser utilizada em estudos em epiderme foliar de tabaco e que foi utilizada, neste trabalho, para transformar células BY-2. Foi demonstrada a importância da presença do linker no correcto endereçamento e processamento da cardosina A em células de tabaco e foram transformadas células BY-2 com as cardosinas A e B em fusão com proteínas fluorescentes. Por análise das linhas celulares transformadas verificou-se que a cardosina A em associação com GFP foi expressa em células BY-2, tendo a cardosina A sido detectada na sua forma madura, por imunodetecção, e identificada no retículo endoplasmático e em estruturas pontuadas, por microscopia confocal. Estas estruturas pontuadas apresentaram um comportamento típico de Golgi na presença de Brefeldina A. Neste trabalho, são discutidas as possíveis situações que levam à acumulação de GFP no Golgi e à ausência de fluorecência no vacúolo. Para além disso, são também discutidas novas abordagens para a transformação de células BY-2. Estudos futuros deverão centrar-se no trânsito das cardosinas A e B em associação com mCherry em células BY- 2.

Cardosin A and cardosin B are aspartic proteases isolated from the flowers of Cynara cardunculus. Despite their high identity, these proteins have a different location in cardoon flowers, cardosin A accumulates in vacuoles and cardosin B is secreted. Hence, these proteins are considered a good model for the study of intracellular trafficking of plant APs. The heterologous expression of these proteins in Nicotiana tabacum leads to the accumulation of both cardosins in the vacuole, which makes tobacco an interesting biological model to answer different questions about intracellular trafficking of cardosins to the vacuole. So far, studies using tobacco did not clarify the trafficking pathway(s) involved in cardosins vacuolar targeting. Bright Yelllow-2 cells (BY-2) constitute a tobacco cell line that shows several advantages in relation to tobacco plant. In the present work, BY-2 cells were used to introduce a new biological model in the study of cardosins trafficking to vacuole, allowing, at the same time, a comparison of their trafficking in the plant system and in cell culture model. A viable construct was obtained with cardosin A fused with the fluorescent protein mCherry, separated by a linker, which can be used for studies in tobacco leaf epidermal cells and was also used to transform BY-2 cellsn in the present work. The results here presented demonstrated the importance of the presence of the linker for cardosin A correct targeting and processing in tobacco cells. Expression analysis of the BY-2 transformed lines showed that cardosin A fused with GFP was expressed in BY-2 cells and that the cardosin was detected in its mature form, by immunoblotting and was identified in the endoplasmic reticulum and in dot-shaped structures, by confocal microscopy. These dot-shaped structures showed a Golgi typical behavior in the presence of Brefeldin A. The implications which of GFP accumulation in the Golgi apparatus and the absence of fluorescence in the vacuole are herein discussed. Moreover, new approaches to the BY-2 cells transformation are discussed in the present work. Future studies should be focused on cardosins A and B trafficking in association with mCherry in BY-2 cells.