Identification of modulators of ataxin-3 proteotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease

Abstract

At least nine human neurodegenerative diseases are caused by the expansion of CAG repeats within otherwise unrelated genes. In these diseases, including Machado-Joseph disease (MJD), polyglutamine (polyQ) expansions cause the appearance of misfolded protein species, that ultimately lead to the formation of aggregates and neuronal loss. Along with the pathogenic motif, all these diseases have in common the fact that the associated gene products are widely expressed but affect only specific subsets of neurons. This specificity suggests that protein misfolding and its toxic outcomes may be determined by the polyQ-flanking sequences of the specific disease-associated proteins. Ataxin- 3 (ATXN3) is a polyQ protein and expansion of its repetitive glutamine tract causes MJD. MJD is characterized by the formation of ubiquitylated intra-neuronal inclusions but the mechanism underlying mutant ATXN3-mediated neuronal dysfunction still remains unsolved. Caenorhabditis elegans offers unique advantages for examining the aggregation dynamics of aggregation-prone proteins and its toxic effects on individual neurons, since the transparency of all 959 cells allows easy detection of fluorescent proteins in live animals. Despite having relatively few neurons, C. elegans display a wide array of complex behaviors and a clear link exists between the behavior and the function of neuronal subsets. In this study, we established a novel pan-neuronal C. elegans model for the study of ATXN3 pathogenesis. Pan-neuronal expression of mutant ATXN3 leads to a polyQ-length dependent, neuron subtype-specific aggregation and neuronal dysfunction. Analysis of different neurons revealed a pattern of dorsal nerve cord and sensory neuron processes susceptibility to mutant ATXN3 that was distinct from the aggregation and toxicity profiles of polyQ-alone proteins. This suggests that the sequences flanking the polyQ-stretch in ATXN3 have a dominant influence on cell-intrinsic neuronal factors that modulate polyQ-mediated pathogenesis. We investigated the role of the wild-type (WT) ATXN3 in polyQ-related pathogenesis and found that WT ATXN3 is irreversibly recruited into polyQ-containing cellular aggregates, aggravating the animals’ motor dysfunction. In contrast, genetic ablation of endogenous C. elegans ATX-3 did not modulate MJD pathogenesis. Our findings support the idea that, unlike what happens in other polyQ disorders, WT ATXN3 does not seem to display a neuroprotective role in MJD. We have also found that in C. elegans mutations reducing insulin/insulin growth factor (IGF)-1- like signaling (IIS) pathway partially rescues mutant ATXN3-mediated aggregation and toxicity. Strikingly, other longevity-related pathways showed different effects on ATXN3 proteotoxicity: dietary restricted animals succumbed to neuronal ATXN3 pathogenesis at similar rates to those of regularly fed animals. In turn, mutations leading to altered mitochondrial function and known to lead to increased longevity showed heterogeneous effects: clk-1 mutation severely aggravated mutant ATXN3 pathogenesis, whereas isp-1 mutation caused a significant delay in the appearance of aggregates. These results suggest that, in spite of improving global organism survival, aging-related pathways may not always show a positive effect on conformational disorders. Heat shock factor 1 (HSF-1) plays a neuroprotective role in ATXN3-mediated pathology in C. elegans. However, in mice, genetic reduction of Hsf-1 resulted in comparable motor uncoordination and pathology, when compared with MJD transgenic mice with two copies of Hsf-1 gene, suggesting that one copy of Hsf-1 is sufficient to cope with ATXN3(Q94) proteotoxicity in mice. Lastly, we validated our novel C. elegans model as a tool for identification of potential therapeutic compounds for MJD and established five compounds, potentially involved in heat shock response, autophagy, transcription regulation and longevity, as good candidates to test in higher model organisms for MJD. In summary, this work provided new clues for the study of ATXN3 pathogenesis and the role of the WT protein in disease. It raised new hypotheses regarding the mechanistic link(s) between aging determinants and proteotoxicity. It also made available a valuable C. elegans model/tool for drug discovery and target identification that can be very useful in future therapy development in MJD.

Diferentes doenças neurodegenerativas humanas são causadas por uma expansão de uma repeticão CAG em genes que, de outra forma, não estão relacionados. Neste tipo de doenças, nomeadamente na doença de Machado-Joseph (DMJ), a expansão de poliglutaminas (poliQ) está associada a uma alteração da conformação das proteínas, com consequente formação de agregados e perda de células neuronais. Além do domínio patogénico, todas estas doenças têm em comum o facto de as suas proteínas causadoras terem uma expressão ubíqua, mas somente afectarem populações específicas de neurónios características de cada uma das doenças. Esta especificidade sugere que a agregação proteica e os seus efeitos tóxicos podem ser determinados pela sequência aminoacídica de cada proteína. A ataxina-3 (ATXN3) contém um segmento de poliQ cuja expansão está na origem da DMJ. A DMJ, assim como outras doenças de poliQ, é caracterizada pela formação de inclusões intraneuronais ubiquitiladas, mas o mecanismo associado à disfunção neuronal causada pela expressão da ATXN3 mutante não é totalmente compreendido. O nemátode Caenorhabditis elegans proporciona grandes vantagens no estudo dos efeitos tóxicos de proteínas poliQ em neurónios, uma vez que a transparência das suas 959 células facilita a detecção de proteínas fluorescentes in vivo. Apesar de apresentarem um número reduzido de neurónios, os C. elegans apresentam inúmeros comportamentos complexos, existindo uma relação clara entre a função de determinados subtipos neuronais e o comportamentos regulados por esses grupos de neurónios. Neste estudo, estabelecemos um novo modelo animal com expressão da ATXN3 humana em todas as células do sistema nervoso dos C. elegans, para o estudo da patogénese da DMJ. A expressão da ATXN3 mutada resulta no aparecimento de agregados e em disfunção neurológica. Ambos os fenótipos dependem do tamanho da sequência de poliQ da ATXN3. A análise de neurónios específicos revelou que os processos de neurónios sensoriais e do cordão nervoso dorsal são especificamente afectados em animais que expressam a ATXN3 mutante e não em animais que expressam proteínas poliQ. Estes resultados sugerem que o efeito das sequências flanqueantes da ATXN3 se sobrepõe a factores intrínsecos ao ambiente neuronal, modulando a patogénese mediada pelo tracto de poliQ. O papel da ATXN3 normal na patogénese da DMJ foi também investigado. Verificámos que a proteína normal é irreversivelmente recrutada para agregados de poliQ, provocando um agravamento do fenótipo motor destes animais. Em contraste, a deleção da ataxina-3 endógena (ATX-3) não modifica o fenótipo do modelo da DMJ em C. elegans. Estes resultados sugerem que, ao contrário do que acontece noutras doenças de poliQ, a ATXN3 WT não parece ter um papel neuroprotector na DMJ. Em C. elegans, mutações que reduzem a sinalização da via da insulina/factor de crescimento da insulina 1 (IIS) revertem parcialmente a agregação e toxicidade causada pela ATXN3 mutante. Surpreendentemente, outras vias que afectam a longevidade de organismos mostraram efeitos diversos na proteotoxicidade da ATXN3: animais em restrição calórica não apresentaram diferenças na patogénese da mediada pela ATXN3 mutada relativamente a animais com uma dieta ad libitum. Mutações que alteram a função mitocondrial e causam aumento da longevidade em C. elegans apresentaram efeitos heterogéneos: a mutação do gene clk-1 agravou o fenótipo de agregação, enquanto que a mutação do gene isp-1 atrasou o aparecimento dos agregados. Estes resultados sugerem que as vias da longevidade, embora aumentem a sobrevivência global dos organismos, nem sempre têm um impacto positivo no tratamento de doenças associadas a conformações proteicas. O factor de choque térmico 1 (HSF-1) desempenha um papel neuro-protector relativamente à proteotoxicidade da ATXN3 em C. elegans. Contudo, em ratinhos esse efeito não é claro. A redução dos níveis do gene Hsf-1 em ratinho resultou num fenótipo de descoordenação motora semelhante ao de ratinhos contendo duas cópias do gene. Este resultado sugere que uma cópia do Hsf-1 é suficiente para combater a proteotoxicidade causada pela ATXN3 quando mutada. Finalmente, validámos o nosso modelo em C. elegans como uma ferramenta para a identificação de potenciais compostos terapêuticos para a DMJ e identificámos cinco compostos, potencialmente envolvidos na regulação da resposta ao choque térmico nas células, na autofagia, na regulação da transcrição e na longevidade, como bons candidatos para testar em modelos da DMJ desenvolvidos em organismos evolutivamente mais próximos do humano, como é o caso do ratinho. Em resumo, este trabalho trouxe novas pistas para o estudo da patogénese da DMJ e para o papel da ATXN3 normal na doença. Também levantou novas possíveis hipóteses no que diz respeito a ligações mecanísticas entre factores que determinam a longevidade dos organismos e a proteotoxicidade. Este novo modelo passou a estar disponível para a comunidade como uma ferramenta para a potencial descoberta de novas drogas e identificação de alvos que podem ser úteis para o desenvolvimento de terapias para a DMJ.