Expressão de cardosinas A e B em linhas transgénicas de Arabidopsis thaliana : caracterização fenotípica e imunolocalização em flores

Abstract

As cardosinas A e B são proteinases aspárticas vegetais presentes em grande abundância nas flores de cardo. No entanto, apesar das suas semelhanças estruturais e moleculares, estas proteínas têm padrões de acumulação diferentes nas flores: a cardosina A é vacuolar e está presente nos vacúolos de armazenamento proteico das papilas estigmáticas, enquanto a cardosina B é secretada e está presente na matriz extracelular do tecido de transmissão. Este facto contribuiu para o crescente interesse nestas proteinases não apenas no que diz respeito às suas possíveis funções, mas também a nível do estudo do trânsito intracelular. Nesse sentido têm sido realizados muitos estudos de forma a elucidar as funções e vias de trânsito seguidas por estas proteínas tanto no sistema nativo como em sistemas heterólogos como tabaco e Arabidopsis. Neste estudo pretendeu-se também avaliar os possíveis efeitos da sobreexpressão destas cardosinas utlizando a planta Arabidopsis thaliana como sistema heterólogo, a expressar de forma estável as cardosinas sob o controlo do promotor 35S Os dados da caracterização fenotípica revelaram que as plantas transformadas não são afectadas ao nível da viabilidade ou fertilidade, no entanto, sofrem um atraso no desenvolvimento em relação às plantas wild type. Foi também realizada imunolocalização das cardosinas A e B em flores fechadas e abertas de Arabidopsis expressando de forma estável as proteínas. Foi observada uma acumulação das cardosinas no citoplasma das células das flores, embora em alguns casos tenha sido possível observar-se cardosina A nos vacúolos das células do tapete e grãos de pólen assim como cardosina B nos vacúolos das células do tapete, em ambos os casos em flores fechadas e quando induzida a expressão desde o início do desenvolvimento. Para além das diferenças de localização a nível intracelular também se verificaram diferenças no padrão de acumulação de ambas as cardosinas a nível tecidular, sendo notória uma marcação mais evidente da cardosina A nas células abaixo das papilas estigmáticas no cortex do estigma e também na zona nucelar, enquanto nas plantas transformadas com a construção que codifica para a cardosina B na zona nucelar não se observou marcação. Pela análise dos dados obtidos, pode-se constatar que a Arabidopsis é um bom modelo para o estudo das cardosinas dado que é capaz de expressar correctamente estas proteínas sem sofrer alterações fenotípicas relevantes que afectem a obttenção da geração seguinte.

Cardosins A and B are plant aspartic proteinases present in high amount in cardoon flowers. However, apart their structural and molecular similarities, these proteins have different accumulation patterns in the flower tissues: cardosin A is a vacuolar protein present in the protein storage vacuoles of stigmatic papillae, while cardosin B is secreted to the extracellular matrix of the transmitting tissue. These facts contributed for the growing interest on these proteinases not only regarding their functions but also in what concerns the study of their intracellular trafficking pathways. Therefore, several studies have been performed to elucidate their physiological roles and trafficking pathways both in the native system and in heterologous systems as tobacco and Arabidopsis. One of the main goals of the present study was to evaluate the possible effects of cardosins over expression using Arabidopsis thaliana as heterologous system, stably expressing cardosins under the control of 35S promoter. The data retrieved from the phenotypic characterizations revealed that the transgenic plants are not affected in terms of viability or fertility, however they suffer a delay in the development when comparing to wild type plants. Immunolocalization studies were also performed to localize cardosins A and B in closed and opened flowers of Arabidopsis plants stably expressing these proteins. Cardosins were found to accumulate in the cytoplasm of the cells, though in some cases cardosin A has been observed in the vacuoles of tapetum cells and in pollen grains, as well as cardosin B in the vacuoles of tapetum cells, in both cases in closed flowers when expression was induced from the beginning of development. Besides the differences observed in terms of intracellular localization, the tissue distribution of both cardosins was also different being notorious the labelling of cardosin A in the cells below stigmatic papillae, in the stigma cortex and also in the nucelar region of the ovule, while in the plants expressing cardosin, the labeling was not observed in the nucelar region. Comparing the overall results with previous data we can suggest that Arabidopsis is a good model for the study of cardosins given the fact that it can correctly express both cardosins without undergoing relevant phenotypic modifications that affect the viability of forthcoming generations.