Characterisation of the molecular interaction between MYB-like transcription factors in the establishment of floral dorsoventral asymmetry in Antirrhinum majus

Abstract

Transcription factor interactions are the cornerstone of combinatorial control, which is a crucial aspect of the gene regulatory system that underlies many developmental processes. In Antirrhinum majus, floral dorsoventral asymmetry is controlled by the combined activity of four transcription factors: CYCLOYDEA (CYC), DICHOTOMA (DICH), RADIALIS (RAD) and DIVARICATA (DIV). CYC, DICH and RAD are expressed dorsally in the floral primordium and promote dorsal petal identity. DIV is expressed in the entire floral primordium, even though it only has a phenotypic effect in more ventral regions. Genetic and molecular studies have revealed that RAD is a direct target of CYC and that that RAD antagonises the activity of DIV. Previous yeast two-hybrid screens led to the identification of two new MYB-like proteins (RADINTERACTING PROTEIN 1 and 2, RIP1 and RIP2) that interact with both RAD and DIV. Therefore, the RIP proteins might also be involved in the antagonism that RAD has on DIV activity, essential for the establishment of flower asymmetry in Antirrhinum. The aim of this thesis was to characterise the molecular antagonism between RAD and DIV, either through direct interaction or indirectly by competition for the RIP proteins. The results from a DNA-binding assay revealed that RAD does not target directly DIV or the DNA targets of DIV, suggesting that the RIP proteins might be bridging the molecular antagonism between RAD and DIV. A sub-cellular localization assay revealed that the RIP proteins co-localised with RAD and DIV in the nucleus, which means that these proteins are able to interact in the same sub-cellular compartment. A quantitative yeast-two hybrid result indicated that RAD interacts more strongly with the RIP proteins than DIV. This result suggest that the RIP proteins might be co-factors essential for DIV function that are sequestered in the dorsal domain by RAD, restricting DIV activity to the ventral petal. The role of the RIP proteins in the molecular antagonism between RAD and DIV will be further addressed using proteinprotein interaction assays in vitro and in planta.

A interacção entre factores de transcrição é a base do sistema de regulação genética e em maior instância do desenvolvimento. Em Antirrhinum majus a assimetria dorsoventral da flor é controlada pela acção combinada de quatro factores de transcrição: CYCLOYDEA (CYC), DICHOTOMA (DICH), RADIALIS (RAD) e DIVARICATA (DIV). CYC, DICH e RAD são expressos dorsalmente no primordio floral promovendo a identidade dorsal das pétalas dorsais. DIV é expresso em todo o meristema floral, no entanto, os seus efeitos fenotípicos são evidentes apenas nas regiões mais ventrais. Estudos genéticos e moleculares revelaram que RAD é responsável pelo antagonismo da actividade de DIV. Recentemente num yeast two-hybrid foram identificados dois novos factores de transcrição do tipo MYB (RAD-INTERACTING PROTEIN 1 e 2, RIP1 e RIP2) que interagem com RAD e DIV. É possível que as proteínas RIP também estejam envolvidas no antagonismo entre RAD e DIV. O principal objectivo desta tese é a caracterização do antagonismo molecular entre as proteínas RAD e DIV, quer por interacção directa entre RAD e DIV ou por competição pelas proteínas RIP. O resultado de um ensaio de ligação ao DNA revelaram que RAD não interage directamente com DIV, nem com os alvos de DNA de DIV, sugerindo que as RIP poderão ter um papel na mediação do antagonismo molecular entre RAD e DIV. Um ensaio de sub-localização celular demonstrou que as proteínas RIP co-localizam com RAD e DIV no núcleo, o que indica que as proteínas tem a possibilidade de interagir no mesmo compartimento subcelular. Um ensaio yeast-two hybrid quantitativo revelou que RAD tem maior afinidade para as proteínas RIP que DIV. Os resultado sugerem a hipótese que as proteínas RIP poderão ser cofactores essenciais para a função de DIV e que na presença de RAD, as RIP são sequestradas, restringindo a actividade de DIV ao domínio ventral onde RAD não está presente. O papel das proteínas RIP no antagonismo molecular entre RAD e DIV será explorado em ensaios futuros que abrangerão o estudo da interacção das proteínas in vitro e in planta.