Stress-related genes in Arabidopsis thaliana: investigating the role of squalene epoxidases in sterol biosynthesis and EGY3 as a putative plastidial heat stress determinant

Abstract

A worldwide effort in plant science research has been carried out over the last years as a response to the aggravated impact that environmental stresses are having on crop production and yield. The main problem is arguably the lack of water availability in the soil, as a consequence of heat, drought, salt and osmotic stresses. This research includes the fundamental aspects that help to understand the mechanisms behind plant growth and development, as well as their response to the external challenges that determine tolerance leading to increase production and finally survival. Using the model plant Arabidopsis thaliana, three genes were studied within the scope of the present thesis. By investigating their role in plant development and particularly abiotic stress, the aim is to contribute to the undergoing effort of improving knowledge-based plant production. SQE1 encodes the main squalene epoxidase (SQE) in the sterol biosynthetic pathway and has been shown to be an abiotic stress determinant gene required for the regulation of reactive oxygen species and drought tolerance. The SQE1 homologues, SQE2 and SQE3, have been shown to possess squalene epoxidase activity based on yeast complementation, but their roles in plant development or as potential abiotic stress determinants have not been elucidated. The current study of SQE genes in Arabidopsis has revealed a complex regulation of sterol biosynthesis. Present analysis shows a low expression of SQE2 relative to SQE3 using promoter-GUS histochemical analysis, with SQE3 being highly expressed in seedlings and in reproductive tissues, corroborating microarray expression data available in public databases. Isolation of loss-of-function mutants for both genes together with terbinafine analysis, an inhibitor of SQEs, have shown an in planta role for SQE3 in squalene epoxidation but not for SQE2, which suggests a role for this gene different to the biosynthesis of bulk sterols. Interestingly, and based on promoter swap fusions it was also shown that SQE2 and SQE3 were unable to complement SQE1 function in the dry2/sqe1-5 mutant, excluding redundancy within this gene family. The lack of complementation of SQE3 cannot be explained by a different subcellular localisation, since translational fusions showed that both, SQE1 and SQE3, are present in the endoplasmic reticulum. Sterol profiling revealed a deregulation in the sterol content of sqe3-1 shoots, while dry2/sqe1-5 was already reported to have an important deregulation of sterol content in roots, which indicate different roles depending on the tissue. The double mutant dry2/sqe3-1 was infertile, indicating that SQE3 has an important role in plants with reduced SQE1 activity. Research on the heterozygous dry2/dry2 SQE3/sqe3-1 showed seed/embryo impairment resulting in a 21% abortion ratio, against the 6% of dry2/dry2 SQE3/SQE3, which highlights the importance of sterols produced by SQE3 during embryo/seed development. A series of phenotype characterisations were conducted involving the potential role of SQE2 and SQE3 in abiotic stresses. Altered responses to heat shock for sqe2-1 as well as salt, osmotic and ABA treatments for sqe3-1 were investigated based on gene expression data gathered from public microarray information. However, none displayed differential responses compared to wild-type plants. Biotic stress challenge with the bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto) was also analysed for SQE3, based on the predicted expression pattern and the putative hypothesis that SQE3 could provide 2,3-oxidosqualene to the lanosterol pathway. Infection with Pto was performed in sqe3-1 plants, since LAS1, the next enzyme in the pathway, also showed induction in these conditions. However, no clear differences were found and therefore our results were inconclusive. Following a web-based data-mining strategy to search for uncharacterised genes putatively involved in abiotic stress responses, EGY3, an EGY-like putative metalloprotease, was identified, for being an unresolved plastid-targeted protein. EGY3 presents high expression during heat stress and in response to other abiotic stresses. Results of GUS histochemical analysis demonstrated high expression in seedlings, stele and pericycle cells of the root, lateral root primordia, and in several flower organs. Gene expression analysis showed that EGY3 was induced by heat stress, and loss-of-function egy3-1 mutants presented a heat-related germination phenotype, with mutant seeds showing more tolerance to high temperatures. Due to the high EGY3 expression in the root and the presence of a heat-related phenotype, analysis of egy3-1 root architecture was also performed in both normal and heat stress conditions. Differences between different genotypes were not found under the same conditions; however, significant differences were encountered within the same genotype in response to heat stress, displaying a heat inducible formation of lateral roots in the wild-type, and an increase in total root length in the mutant egy3-1. Analysis of developmental and growth phenotypes of egy3-1 mutants revealed delayed flowering, late growing, bushier plants and prolonged life cycle. These results not only implicate this gene in the heat stress response but also in circadian rhythm mechanisms and the onset of flowering. This was further supported by analysis of the promoter for the identification of cis-element presence, with the finding of binding sites of putative TFs related to seed development, abiotic stresses, lateral root, rosette development, and senescence induction. Moreover, in silico analysis suggested that EGY3 is regulated by HsfA2, and is co-expressed with other HSF and HSP, reinforcing its role in heat stress. EGY3 expression in microarrays of known mutants revealed, among others, a deregulation in its expression in mutants involved in heat stress (HSFs), as well as the onset of flowering, the coordination of plant development and the promotion or repression of the transcription of photosynthesis associated nuclear genes (ein3/eil1, cop1 and hy5). A construct to obtain complementation and overexpression lines was developed and transformed into egy3-1 and wild-type plants, respectively. Constructs to express recombinant EGY3 in Escherichia coli have also been performed in order to produce, purify and analyse its catalytic activity. Additional functional studies are underway, including GFP-mediated subcellular localisation, which will be used to characterise the role of EGY3 in development and heat stress responses.

Nos últimos anos, a investigação em biologia vegetal tem-se focado em responder ao grave impacto que os stresses ambientais (e.g. disponibilidade de água nos solos, calor, frio, secura, salinidade) provocam na produção e rendimento agrícolas. Esta investigação é crucial para permitir a compreensão dos mecanismos que permitem o crescimento e desenvolvimento das plantas, assim como a resposta aos estímulos externos que determinam a sua sobrevivência/tolerância. Neste trabalho, recorrendo à espécie modelo Arabidopsis thaliana, foi estudada a função dos genes SQE2, SQE3 e EGY3, dado o possível papel no desenvolvimento da planta e, particularmente, como determinantes na resposta a stresses abióticos. O gene SQE1 codifica a principal esqualeno epoxidase da via biossintética dos esteróis, tendo-se já demonstrado ser um gene determinante para o stresse abiótico, pois está envolvido na tolerância à secura e na regulação de espécies reativas de oxigénio. Os genes SQE2 e SQE3, homólogos de SQE1, mostraram possuir atividade esqualeno epoxidásica em levedura, mas o seu papel no desenvolvimento vegetal, e como potenciais determinantes do stresse abiótico, ainda não foram elucidados em Arabidopsis. O estudo dos homólogos do SQE1 revelou existir uma regulação complexa na biossíntese dos esteróis. Os resultados demonstraram baixa expressão do SQE2 em comparação com a do SQE3, em ensaio GUS (gene-repórter). O SQE3 é muito expresso em plântulas e tecidos reprodutivos, o que é sustentado pelos dados de expressão dos microarrays de bases de dados públicas. Os mutantes de perda de função para ambos os genes foram tratados com terbinafina (inibidor específico da esqualeno epoxidase), tendo os mutantes sqe3-1 apresentado elevada sensibilidade ao inibidor, o que sugere um papel in planta para o SQE3, enquanto que a falta de sensibilidade de sqe2-1 poderá indicar um diferente papel para este gene. A recuperação do fenótipo de dry2/sqe1-5 com o SQE2 e o SQE3 não foi obtida, pelo que se exclui uma total redundância dentro desta família. Ensaios para a localização subcelular permitiram evidenciar que SQE1 e SQE3 estão presentes no mesmo compartimento, o retículo endoplasmático. O perfil do esqualeno e de alguns esteróis revelou uma desregulação ao nível da parte aérea de sqe3-1, enquanto que em dry2/sqe1-5 dados prévios evidenciaram uma desregulação importante ao nível das raízes, o que pode indicar algum grau de especificidade a nível do tecido. O duplo mutante dry2/sqe3-1 é infértil, agravando o frágil fenótipo de dry2/sqe1-5. A investigação sobre o heterozigótico dry2/dry2 SQE3/sqe3-1 revelou que este exibe uma taxa de aborto de 21%, contra a de 6% do dry2/dry2 SQE3/SQE3, o que sugere um papel parcialmente redundante do SQE3 no desenvolvimento do embrião/semente, conjuntamente com SQE1. Uma série de ensaios fenotípicos foram efetuados envolvendo SQE2 e SQE3 no stresse abiótico. Alterações a nível do choque térmico (sqe2-1) e tratamentos com sal, ABA e mannitol (sqe3-1) foram averiguados com base nos padrões de indução face a estes stresses, a partir de dados de microarrays. No entanto, não se observaram diferenças significativas quando comparados com o ecótipo selvagem. Ensaios de infeção com a bactéria patogénica Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto) foram efetuados no sqe3-1, tendo por base a premissa de que o gene era sobre-expresso nestas condições e na hipótese de que SQE3 poderia fornecer 2,3-oxidoesqualeno à via do lanosterol, uma vez que LAS1, a seguinte enzima desta via, também demonstrou um padrão similar de indução. Contudo, os resultados de infeção foram inconclusivos. Uma estratégia de prospeção de dados baseada em recursos bioinformáticos foi desenvolvida para identificar genes ainda não caracterizados que estivessem envolvidos na resposta ao stresse abiótico. Desta análise, foi selecionado EGY3, que codifica uma putativa metalloprotease do tipo EGY, prevista para o cloroplasto. O EGY3 apresenta elevada expressão durante o stresse pelo calor e em resposta a outros stresses. Resultados do ensaio GUS demonstraram elevada expressão em plântulas, cilindro central e células do periciclo da raiz, primórdios das raízes laterais e em diversos órgãos florais. A análise da expressão do EGY3 demonstrou a sua indução pelo calor e o seu mutante de perda-de-função apresentou um fenótipo associado à germinação pelo calor, com sementes mais tolerantes a altas temperaturas. Devido à expressão específica na raiz e a presença deste fenótipo pelo calor, uma análise da arquitetura da raiz foi conduzida no egy3-1 em condições de crescimento normal e de choque térmico. Não houve diferenças entre genótipos idênticos, mas verificou-se indução pelo calor do comprimento das raízes laterais de plantas selvagens e do comprimento total da raiz do mutante. Por sua vez, a análise de fenótipos de desenvolvimento e de crescimento revelaram ocorrer floração e crescimento tardios, plantas mais robustas, e com ciclo de vida mais extenso. Estes resultados implicam o EGY3 na resposta ao stresse pelo calor, nos mecanismos do ritmo circadiano e no ínicio da floração. Isto é suportado pela análise de elementos cis no promotor do gene, onde os fatores de transcrição correspondentes estão envolvidos em processos como o desenvolvimento da semente, stresse abiótico, raízes laterais, desenvolvimento da roseta e indução da senescência. Análises in silico também sugerem que EGY3 seja regulado por HsfA2 e coexpresso com outro HSF e HSPs, o que reforça o seu envolvimento no stresse pelo calor. A expressão de EGY3 em microarrays de mutantes conhecidos revelou uma desregulação da sua expressão em mutantes envolvidos no stresse pelo calor (HSFs), assim como no ínicio da floração, na coordenação do desenvolvimento da planta e na promoção/repressão da transcrição de genes nucleares associados à fotossíntese (ein3/eil1, cop1 e hy5). Para obter complementação e linhas de sobre-expressão foram obtidas construções para o efeito, transformadas no mutante egy3-1 e em plantas selvagens, respetivamente. Para expressar EGY3 num sistema heterólogo (E. coli) foram obtidas construções que no futuro serão utilizadas para a produção da proteína EGY3, sua purificação e subsequente análise da atividade catalítica. Estudos funcionais adicionais, incluindo a localização subcelular por GFP, estão a ser desenvolvidos no sentido de caracterizar o papel de EGY3 no desenvolvimento e na resposta ao stresse pelo calor.