Functional characterisation of a new class of MYB-like genes in Arabidopsis thaliana and Antirrhinum majus

Abstract

Floral asymmetry is a trait that has evolved many times independently in different angiosperm lineages from a radially symmetrical ancestral condition. Therefore, it provides a good system to study how a pathway that is responsible for the establishment of a new trait has evolved. In Antirrhinum majus, floral asymmetry requires the combined activity of four transcription factors: CYC, DICH, RAD and DIV. CYC, DICH and RAD are expressed dorsally in floral primordia and promote dorsal petal identity. DIV is expressed all round the floral primordium, even though it only has a phenotypic effect in more ventral regions. Genetic and molecular studies have revealed that RAD is a direct target of CYC and antagonises the activity of DIV. This was further explored by using yeast twohybrid screens, which led to the identification of two novel related MYB-like proteins (RIPs, RAD-interacting proteins) that interact with both RAD and DIV. Therefore, the RIP proteins might also be involved in the antagonism that RAD has on DIV activity, essential for the establishment of flower asymmetry in Antirrhinum. The aim of this thesis was to initiate the characterisation of the function of the RIP genes in Antirrhinum. Furthermore, the function of the RIP homologs in Arabidopsis, the RIP-like genes (RIPLs), was also studied in order to give insights into an ancestral role of the RIP family, before dorsoventral asymmetry of flowers has evolved. Results from the study of the expression pattern of the RIP genes revealed that these genes are expressed in the early developmental stages of floral meristems, and are co-localised with the expression pattern of RAD and DIV. This result further supports the hypothesis that the RIP genes might be implicated in the antagonism that RAD exerts over DIV function, restricting DIV activity only to the ventral petal. The extent of which the RIP genes affect floral development will be further addressed by analysing RIP mutant plants. The screening for these mutants was performed on an Antirrhinum transposon mutant collection. In Arabidopsis, five RIP homologs were identified and expression studies performed on these genes revealed that RIPL1, the closest RIP homolog, is also expressed in young floral meristems. However, RIPL1 expression is also extended to other organs. These results suggest that the RIPL genes might be implicated in other developmental functions in Arabidopsis. The function of the RIPLs will be further investigated by analysing the mutant lines obtained during this work. Additionally, transgenic Arabidopsis plants over-expressing the RIPLs:GFP fusion proteins will be generated with the constructs obtained in this work.

A assimetria floral é uma característica que evoluiu diversas vezes de forma independente em múltiplas linhagens de angiospérmicas a partir de espécies ancestrais com flores simétricas. Consequentemente, consiste num bom modelo de estudo para compreender as interacções moleculares responsáveis pelo estabelecimento de uma nova morfologia. Em Antirrhinum majus, a assimetria floral é regulada conjuntamente por quatro factores de transcrição: CYC, DICH, RAD e DIV. CYC, DICH e RAD são expressos dorsalmente no primórdio floral e promovem a identidade das pétalas dorsais. Apesar de influenciar unicamente o desenvolvimento das zonas ventrais, DIV é expresso por todo o primórdio floral. Estudos de genética e biologia molecular revelaram que RAD é regulado por CYC e que antagoniza a função de DIV. Através de um ensaio yeast two-hybrid foram identificadas duas proteínas similares, com um novo domínio MYB-like (RIPs, RADinteracting proteins), que interagem tanto com RAD como com DIV. As proteínas RIPs poderão estar envolvidas no antagonismo que RAD exerce sobre DIV, que se revela essencial para o desenvolvimento da assimetria floral em Antirrhinum. O objectivo desta tese consistiu em iniciar a caracterização funcional dos genes RIP em Antirrhinum. Adicionalmente, foram também caracterizados os homólogos dos genes RIPs em Arabidopsis: os genes RIP-like (RIPLs). O estudo dos RIPLs permitirá perceber qual o papel que esta nova família de factores de transcrição possivelmente desempenhava anteriormente ao aparecimento da assimetria floral. Os resultados obtidos no estudo do padrão de expressão dos genes RIP revelam que estes genes são expressos nos estágios iniciais de desenvolvimento dos meristemas florais e estão co-localizados com o padrão de expressão de RAD e DIV. Estes resultados apoiam a hipótese de que as RIPs estarão envolvidas no antagonismo que RAD exerce sobre DIV, restringindo a actividade de DIV à pétala ventral. De modo a compreender o papel que os RIPs terão no desenvolvimento floral serão analisadas plantas mutadas nestes genes. De modo a encontrar estes mutantes foi feito um rastreio de uma colecção de mutantes por inserção de transposões em Antirrhinum. Foram identificados cinco homólogos dos RIPs em Arabidopsis e o estudo dos seus padrões de expressão indicam que o homólogo mais similar aos RIPs, RIPL1, é também expresso nos meristemas florais. No entanto, a expressão do RIPL1 estende-se também a outros órgãos. Estes resultados sugerem que os genes RIPL poderão estar implicados noutras funções relacionadas com o desenvolvimento de Arabidopsis. A função dos RIPLs será estudada através da análise de linhas mutantes obtidas durante este trabalho. Adicionalmente, serão analisadas plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpressam proteinas fusão RIPLs:GFP desenvolvidas durante este trabalho.