Nutrition and chemoprevention of colorectal cancer

Abstract

exogenous and endogenous agents. These damages, when not repaired properly, can generate mutations in somatic or germline cells, which are involved in the pathogenesis of many diseases, including cancer. In the last decades, epidemiological studies as well as laboratory data suggest that consumption of some fruits and vegetables and a correct lifestyle is associated with a reduced risk of developing CRC. Multiple mechanisms have been proposed to explain the chemopreventive effects of phytochemicals. Protection of DNA from damage and modulation of DNA repair assume an important role on prevention of mutations and consequently of the carcinogenic process.The global aim of this work was to clarify the role of the consumption of some plants of genus Salvia and their individual phytochemicals on DNA damage prevention and induction of DNA repair and consequent effect on colon cancer prevention. Their potential interaction with alkylating agents used as chemotherapeutic drugs was also evaluated. In the first study (Chapter II) we evaluate the effects of three Salvia sp. water extracts, Salvia officinalis (SO), Salvia fruticosa (SF), and Salvia lavandulifolia (SL), and the main phenolic constituents rosmarinic acid (RA) and luteolin-7-glucoside (L-7-G) on DNA protection against oxidative damage in two human cell lines, Caco-2 and HeLa cells. SF, RA, and L-7-G significantly decreased DNA strand breaks induced by H2O2 in Caco-2 cells. The protective effects were more pronounced at a short period (2h) than at a long period of incubation (24h). In contrast, in HeLa cells, SO, SF, and RA had protective effects against damage induced by H2O2 after a long period of incubation. Protection against 8-oxoGua, a specific base oxidation, was conferred by RA in Caco-2 cells after a short period of incubation, while no protective effects were observed in HeLa cells. Effects of the three Salvia sp. water extracts and phenolic compounds on DNA repair in Caco-2 cells were also assessed (Chapter II). Pre-incubation for 24h with SO, SF and L-7-G increased the extent of rejoining of strand breaks in Caco-2 cells after treatment with H2O2. SO and L-7-G also have a BER inductive effect in Caco-2 cells. In the second study (Chapter II) the effects of two common compounds, ursolic acid (UA) and luteolin (Lut), present in Sage plants and also in fruits, vegetables and spices, on DNA protection against oxidative DNA damage and modulation of DNA repair in human colon cells (Caco-2) were evaluated. We showed that both compounds, Lut and UA, protected DNA of Caco-2 cells from strand breaks induced by H2O2. However, only Lut protected DNA against 8-oxoGua in Caco-2 after a short period of incubation. On DNA repair, pre-incubation for 24h with UA or Lut increased the extent of rejoining of strand breaks. UA also had a BER inductive effect, increasing incision activity of a Caco-2 cell extract. In the third study (Chapter III) effects of the three Salvia sp. water extracts and the main phenolic constituent, RA, on DNA protection and repair of DNA damage induced by the oxidative and alkylating agents in two colon cancer cell lines, HCT15 and CO115 cells were evaluated. Salvia extracts protected against H2O2-induced DNA damage in HCT15 cells (SO and SF) and also protected CO115 cells from DNA damage induced by MNU (an alkylating agent) (SO and SL). This protection may be beneficial as a chemopreventive mechanism; however may decrease therapeutic efficacy of alkylating anticancer drugs. So, another aim of this study was to evaluate if consumption of Salvia sp. and RA might interfere with alkylating agents used in cancer therapy such as BCNU. We showed that the Salvia extracts tested and RA decreased DNA damage induced by BCNU, in CO115 (SO, SF, SL and RA) and HCT15 cells (SF). No effect was observed on MPG protein expression, a DNA repair enzyme involved in Nalkylations repair. In the fourth study (Chapter IV), we develop a new application of the comet assay to assess mutagenic alkylation DNA damages, specifically, O6meG levels in proliferative and MMR proficient cells by the use of a specific inhibitor of MGMT. With this new application we expect to contribute to the widespread use of the comet assay to test potential chemopreventive and chemotherapeutic drugs that act by inducing the activity of MGMT and the repair of O6meG base damage. In conclusion our results showed that Salvia extracts and some isolated compounds tested have effect on DNA damage protection not only against oxidative but also against alkylating DNA damage. Enhancement of DNA repair is another important mechanism that is involved in the chemopreventive effect of Salvia extracts and the phytochemicals tested.

Os danos no ADN acumulam-se nas células ao longo do tempo como resultado da exposição a uma grande variedade de agentes endógenos e exogenos. Estes danos, se não forem devidamente reparados, podem gerar mutações em células somáticos ou germinais, os quais estão envolvidos na patogenicidade de muitas doenças, como o cancro. Nas últimas décadas, estudos epidemiológicos, assim como resultados laboratoriais sugerem que o consumo de alguns frutos e vegetais está associado ao baixo risco de desenvolver CRC. Diversos mecanismos têm sido propostos para explicar os efeitos quimopreventivos dos fitoquímicos. A proteção dos danos no ADN e a reparação do ADN assumem um importante papel na prevenção das mutações e consequentemente prevenção do processo carcinogénico. O objectivo geral deste trabalho foi esclarecer sobre o papel do consumo de algumas plantas do género Salvia e de alguns dos seus fitoquímicos na prevenção dos danos no ADN e indução da reparação do ADN e consequente efeito na prevenção do CRC. A sua potencial interação com agentes alquilantes usados como fármacos quimioterapêuticos foi também avaliada. No primeiro estudo (capítulo II) avaliamos o efeito dos extratos aquosos de três plantas do género Salvia, Salvia officinalis (SO), Salvia fruticosa (SF) e Salvia lavandulifolia (SL) e os seus principais constituintes, ácido rosmarínico (AR) e a luteolina-7- glucosídeo (L-7-G) na proteção do ADN contra danos oxidativos em duas linhas celulares humanas, Caco-2 e HeLa. SF, RA e L-7-G diminuem significativamente as quebras no ADN induzidas pelo H2O2 em células Caco-2. O efeito protetor foi mais evidente para períodos curtos de incubação (2h) do que para períodos longos (24h). Pelo contrário, em células HeLa, SO, SF e AR tiveram um efeito protetor contra danos induzidos pelo H2O2 após um longo período de incubação. A proteção contra 8-oxoGua, que é uma base oxidada, foi conferida pelo AR em células Caco-2 após um curto período de incubação, enquanto em células HeLa não foi observado efeito protetor. O efeito dos extratos aquosos das três plantas do género Salvia e dos compostos fenólicos na reparação do ADN foi também avaliado em células Caco-2. A pré-incubação de 24h com SO, SF e L-7-G aumentou a reparação das quebras de cadeia em células Caco-2 após tratamento com H2O2. SO e L-7-G também tiveram um efeito indutivo no sistema de reparação BER em células Caco-2. No segundo estudo (capítulo II) foram avaliados os efeitos de dois compostos, o ácido ursólico (AU) e a luteolina (Lut), que estão presentes nas plantas do género Salvia e também em frutos, vegetais e especiarias, na proteção do ADN contra danos oxidativos e na reparação do ADN em células humanas do colon (Caco-2). Demonstramos que ambos os compostos, Lut e AU, protegeram o ADN das células Caco-2 das quebras de cadeia induzidas pelo H2O2. No entanto, apenas a Lut protegeu as células Caco-2 contra 8-oxoGua após um curto período de incubação. Na reparação do ADN, uma préincubação de 24h com o UA ou Lut aumentou a reparação das quebras de cadeia. O AU também teve um efeito indutor no sistema de reparação BER, aumentando a actividade de corte do extrato celular de Caco-2. No terceiro estudo (capítulo III) foram avaliados os efeitos dos extratos aquosos das três plantas do género Salvia e do principal constituinte fenólico, o AR, na proteção e reparação do ADN contra danos induzidos por agentes oxidativos e alquilantes em duas linhas celulares do cancro do cólon, HCT15 e CO115. Os extratos de salvia protegeram contra os danos no ADN induzidos pelo H2O2 nas células HCT15 (SO e SF) e também protegeram as células CO115 dos danos no ADN induzidos pelo MNU (que é um agente alquilante) (SO e SL). Esta proteção pode ser benéfica como mecanismo quimiopreventivo, no entanto pode diminuir a eficácia terapêutica dos fármacos alquilantes anticancerígenos. Um outro objectivo deste trabalho foi avaliar a potencial interação entre o consumo de plantas do género Salvia e do AR com os fármacos alquilantes usados na terapia do cancro, como por exemplo o BCNU. Demonstramos que os extratos de Salvia e o AR diminuíram os danos no ADN induzidos pelo BCNU em células CO115 (SO, SF, SL e AR) e em células HCT15 (SF). Não foram observados efeitos na expressão da proteína MPG, uma importante enzima de reparação do ADN involvida na reparação dos danos N-alquilantes. No quarto estudo (capítulo IV), desenvolvemos uma nova aplicação do ensaio cometa para avaliar danos alquilantes mutagénicos, especialmente O6meG em células proliferativas e com o sistema de reparação MMR funcional, usando um inibidor específico da MGMT. Com esta nova aplicação, nós esperamos contribuir para um maior uso do ensaio cometa para testar agentes quimiopreventivos e fármacos quimioterapêuticos que atuam através da indução da actividade da MGMT e reparação do dano O6meG. Em conclusão, os nossos resultados mostraram que os extratos de Salvia e alguns dos compostos testados tem efeito na proteção do ADN não só contra danos oxidativos mas também contra danos alquilantes. A reparação do ADN é um outro importante mecanismo que está involvido nos efeitos quimiopreventivos dos extratos de Salvia e dos fitoquímicos testados.