Looking for novel physiological regulators of lung development

Abstract

Pediatric and adult diseases characterized by lung hypoplasia or dysplasia are an epidemiologicalb relevant issue, involving important morbidity and mortality rates. The understanding of the complex process of lung development, regulated by several genetic, chemical and physical determinants, has clinical relevance since it can open new perspectives in the treatment of these lung diseases as well as modulation of lung repair. Regardless of the advanced knowledge of normal lung growth, there are several possible regulators and determinants that need to be investigated. Therefore, the main aim of the present dissertation was to discover novel physiological regulators of normal lung morphogenesis, expecting to contribute for the development of new strategies for lung diseases, namely for fetal lung hypoplasia, in context of congenital diaphragmatic hernia (CDH). Using different laboratorial approaches, namely histological, molecular, and functional studies, the role of glycoprotein 130 (gp130) family of cytokines and renin-angiotensin system (RAS) was evaluated throughout fetal lung development, in rat model of either normal and hypoplastic (the nitrofen-induced CDH model) lung development.. In this thesis, it was demonstrated that interleukin 6 (IL-6) and leukemia-inhibitory factor (LIF) are constitutively expressed during fetal lung development and they have a physiological role on pulmonary branching mechanisms. Indeed, cytokines signaling through gp130 homodimers (IL-6 and IL-11) stimulate lung branching, whereas cytokines acting in a gp130 heterodimer receptor (LIF, oncostatin M) inhibit lung growth. It was also established that there is a local and physiologically active RAS during lung morphogenesis. In fact, all RAS components are constitutively expressed in the lung throughout gestation and angiotensin II (ANG II), the physiologically active peptide of RAS, induces a stimulatory effect on lung branching, mediated by type 1 (AT1) receptor of ANG II, through p44/42 and Akt phosphorylation. After the description of these two new physiological regulators/modulators of fetal lung growth, gp130 family of cytokines and RAS, their role in pulmonary hypoplasia, in the CDH context, were assessed. First of all, it was showed that hypoplastic fetal lung has the intrinsic ability to regulate its growth and to recover from growth retardation through a way that resembles the catch-up growth phenomenon. Moreover, IL-6 might be involved in the mechanisms underlying this phenomenon. Finally, the discovery of RAS as a new regulator of fetal lung growth allowed the establishment of an antagonist of type 2 (AT2) receptor of ANG II (PD-123319) as a putative antenatal therapy for pathologies characterized by fetal lung hypoplasia, such as CDH. In vivo, in nitrofen-induced CDH model, antenatal PD-123319 treatment improved the key determinants of mortality associated with CDH, namely lung hypoplasia and pulmonary hypertension, and also improved lung function and survival, without maternal or fetal deleterious effects. In summary, in this thesis, according to the proposed aims, two novel physiological regulators of fetal lung development were identified: gp130 family of cytokines and local lung RAS. Moreover, we demonstrated that fetal lung has the intrinsic ability to regulate its growth and proposed a model for regulation of correct lung size and growth. Nonetheless, future studies are necessary to clarify this regulatory loop and the mediators (afferent arms, sensors, efferent arms) involved on this hypothetic feedback mechanism of compensatory growth. Finally, we established that selective inhibition of AT2 receptor is a putative antenatal therapy for pathologies characterized by lung hypoplasia, such as CDH, which open perspectives for future pre-clinical studies.

As doenças pulmonares pediátricas ou do adulto, que cursam com hipoplasia ou displasia pulmonar, associam-se a elevadas taxas de morbilidade e mortalidade. A compreensão dos mecanismos complexos do desenvolvimento pulmonar, regulados por determinantes genéticos, químicos e mecânicos, apresenta relevância clínica ao permitir o desenho de novas abordagens terapêuticas que mimetizem o normal crescimento e maturação pulmonares, bem como a regeneração pulmonar. Nos últimos anos, o conhecimento sobre desenvolvimento pulmonar normal muito ter evoluído. Contudo, são vários os fatores de crescimento e reguladores que permanecem por esclarecer. Assim, nesta dissertação investigaram-se novos reguladores fisiológicos da morfogénese pulmonar, procurando contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para as doenças pulmonares, nomeadamente a hipoplasia pulmonar fetal, no contexto da hérnia diafragmática congénita (HDC). No modelo animal do rato, quer em animais controlo quer no modelo de HDC induzida pelo nitrofeno, a função da família das citocinas da glicoproteína 130 (gp130) e do sistema reninaangiotensina (SRA) foi avaliada ao longo do desenvolvimento pulmonar fetal. Diferentes técnicas laboratoriais foram utilizadas, nomeadamente estudos histológicos, moleculares e funcionais. Os nossos resultados demonstraram que a interleucina 6 (IL-6) e o fator inibidor da leucemia (LIF) são constitutivamente expressos ao longo do desenvolvimento pulmonar fetal e desempenham um papel fisiológico nos mecanismos de ramificação pulmonar. Assim, a IL-6 e a IL-11, cujos recetores são homodímeros da gp130, estimulam a ramificação pulmonar. Por sua vez, o LIF, a oncostatina M, que sinalizam via heterodímeros de gp130, inibem o crescimento pulmonar. Para além disso, foi também descrita a presença de um SRA local e fisiologicamente ativo durante a morfogénese pulmonar. Na verdade, todos os componentes do SRA são expressos no pulmão em todas as idades gestacionais estudadas e a angiotensina II (ANG II), o peptídeo fisiologicamente ativo deste sistema, estimula a ramificação pulmonar, via recetor de tipo 1 (AT1) e a fosforilação da p44/42 e Akt. Uma vez descritos estes dois novos reguladores/moduladores do crescimento pulmonar fetal, a família das citocinas da gp130 e o SRA, o seu papel na hipoplasia pulmonar fetal, no contexto da HDC, foi avaliado. Foi possível demonstrar que o pulmão fetal hipoplásico apresenta capacidade intrínseca para regular o seu crescimento e recuperar do atraso de crescimento por um mecanismo similar ao clássico fenómeno de catch-up growth. A IL-6 revelou-se como um dos mediadores envolvidos nos mecanismos subjacentes a este fenómeno. Finalmente, a descoberta do SRA como um novo regulador do crescimento pulmonar fetal permitiu apresentar o PD-123319, um antagonista específico do recetor de tipo 2 da ANG II (AT2), como um potencial alvo terapêutico para patologias caraterizadas por hipoplasia pulmonar fetal, das quais a HDC é um exemplo. No modelo de HDC induzida pelo nitrofeno, in vivo, a administração materna antenatal de PD-123319 melhorou os determinantes chave associados a esta patologia, nomeadamente a hipoplasia e hipertensão pulmonares, e melhorou a função pulmonar e a taxa de sobrevida, sem aparentes efeitos deletérios maternos ou fetais. Em resumo, nesta tese, de acordo com os objetivos inicialmente estabelecidos, foram identificados dois novos reguladores fisiológicos do desenvolvimento pulmonar fetal: a família das citocinas da gp130 e o SRA pulmonar. Foi, também, demonstrado que o pulmão fetal apresenta capacidade intrínseca para regular o seu crescimento e foi proposta a existência de um modelo de regulação do crescimento pulmonar. Contudo, estudos futuros são necessários a fim de se clarificar este hipotético mecanismo de regulação do crescimento e os seus mediadores (vias aferentes, sensor e vias eferentes). Por fim, a apresentação do recetor AT2 como um potencial alvo terapêutico antenatal para patologias caraterizadas por hipoplasia pulmonar, tais como a HDC, promove o desenvolvimento de estudos pré-clínicos futuros.