Ammonium toxicity in aging yeast cells reduces chronological life span : cell death mechanisms and nutriente sensing pathways

Abstract

Yeast has emerged as one of the most important model organisms to study the environmental and genetic factors affecting longevity and its exploitation has made huge contributions to the progress in understanding aging. Major advances in this research field came from dietary regimes that have been shown to increase longevity in organisms ranging from yeast to mammals. The understanding on how nutrient signaling pathways collaborate to the beneficial effects of dietary restriction can help expose new targets for therapy in the prevention of aged-related diseases. When studying the impact of nutrient-signaling pathways in aging of yeast, by culturing Saccharomyces cerevisiae, the composition of culture media has proven to be an extrinsic factor affecting the chronological life span (CLS). Reducing glucose concentration in the culture medium, is an environmental modulation that was shown to be sufficient to increase CLS. Other components of the culture media and factors such as the products of fermentation have also been implicated in the regulation of CLS. Particularly, the CLS of S. cerevisiae is strongly affected by the concentration of the auxotrophy-complementing amino acid in the medium. In this context, in the present work, we aimed to identify new nutrient signaling capable of regulating S. cerevisiae CLS and uncover the signaling pathways involved. The results obtained show that manipulation of the ammonium (NH4 +) concentration in the culture medium also affects CLS. NH4 + reduced CLS of cells cultured to stationary phase under both standard amino acid supplementation and amino acid restriction conditions, in a concentration-dependent manner, a significant increase in cell survival being observed when the starting NH4 + concentration in the medium was decreased. In cells cultured to stationary phase with amino acid restriction or starved for auxotrophy-complementing amino acids and subsequently transferred to water, the CLS was also significantly shortened by the addition of NH4 +, indicating that ammonium alone could induce loss of cell viability as observed in culture media. Cells starved for auxotrophic-complementing amino acids were particularly sensitive to ammonium-induced cell death and starvation for leucine in particular, largely contributed to this phenotype. Death induced by ammonium in cells starved for auxotrophiccomplementing amino acids (aa-starved cells) was mediated through the regulation of the evolutionary conserved pathways PKA, TOR and SCH9 and accompanied by an initial apoptotic cell death followed by a fast secondary necrosis. Autophagy, which has been described as essential for cell survival during nitrogen starvation and regulating amino acid homeostasis did not seem to have a role in ammonium-induced cell death. The results with aa-starved cells of tor1 , tpk1 and sch9 strains showed that NH4 + toxicity is mediated through the over-activation of PKA and TOR and inhibition of Sch9p, suggesting that the role of Sch9p in the process is essentially independent of the TOR-PKA pathway. Furthermore, it was shown that NH4 + signalling to PKA is mediated via Tor1p and Sch9p but does not depend on Mep2p. This activation of PKA by NH4 + signalling is not dependent on its metabolization as testing for the activity of enzymes involved in the metabolism of NH4 + demonstrated no correlation with NH4 + toxicity. In agreement, the use of the NH4 + non-metabolizable analog methylamine produced the same outcome as NH4 +. As a final result, it was shown that NH4 + toxicity is a generalized effect in aging yeasts, not only dependent on amino acid restrictions, but also present in prototrophic strains. In conclusion, our results point out, for the first time, a role for ammonium as an extrinsic factor affecting CLS regulation in the culture medium joining other known extrinsic factors such as glucose, acetic acid and ethanol. Also, the effects of ammonium toxicity were characterized in yeast for the first time, showing that this process shares common features with NH4 + toxicity in mammalian cells. The model presented in this work may be a powerful system for elucidation of conserved mechanisms and pathways of ammonium toxicity, with important implications in diverse fields extending from diseases associated with hyperammonemia and clarification of longevity regulation in multicellular organisms, to new insights for wine fermentations involving nitrogen supplementation

A levedura Sacharomyces cerevisiae, tem vindo a destacar-se como um dos mais significativos organismos modelo no estudo de factores ambientais e genéticos que afectam a longevidade. A sua utilização na investigação dos processos de envelhecimentos tem gerado importantes contributos neste campo. Muitos dos avanços nesta área de investigação advêm do estudo da influência da dieta na longevidade, com resultados positivos no aumento da longevidade em diversos organismos, desde a levedura até aos mamíferos. O estudo da contribuição das vias de sinalização de nutrientes para os efeitos da dieta na longevidade, pode ajudar na identificação de novos alvos terapêuticos para a prevenção de doenças associadas ao envelhecimento. No estudo do impacto das vias de sinalização de nutrientes no envelhecimento de leveduras, a composição do meio de cultura figura como um dos factores extrínsecos que afecta a longevidade cronológica. Neste âmbito, encontra-se bem documentado na literatura que a redução da concentração de glucose no meio de cultura resulta no aumento da longevidade cronológica da levedura. De forma análoga, outros componentes do meio de cultura, como por exemplo alguns produtos da fermentação alcoólica, estão também envolvidos na regulação da longevidade cronológica da levedura. Adicionalmente, em estirpes auxotróficas de S. cerevisiae, a concentração de aminoácidos essenciais (correspondentes às marcas auxotróficas) no meio de cultura afecta particularmente a longevidade cronológica da levedura. Neste contexto, o presente trabalho teve como objectivo a identificação de novos sinais nutricionais envolvidos na regulação da longevidade cronológica da levedura S. cerevisiae, bem como das vias de sinalização potencialmente envolvidas. Os resultados obtidos mostraram que a manipulação da concentração de amónio no meio de cultura afecta a longevidade cronológica. O amónio reduz a longevidade cronológica de células cultivadas até à fase estacionária, tanto em condições de suplementação standard de aminoácidos essenciais, como em condições de restrição, sendo a redução proporcional à concentração de amónio no meio extracelular. Em consonância, observou-se um aumento significativo na sobrevivência das células quando se reduziu a concentração inicial de amónio no meio de cultura. Por outro lado, em células cultivadas até fase estacionária em condições de restrição de aminoácidos essenciais ou esfomeadas para os mesmos aminoácidos e posteriormente transferidas para água, observou-se um decréscimo significativo na longevidade cronológica da levedura após a adição de amónio, sugerindo que o amónio, por si só, é responsável pela perda de viabilidade celular, tal como observado para células mantidas no meio de cultura. As células esfomeadas para aminoácidos essenciais mostraram ser especialmente sensíveis à morte induzida pelo amónio, tendo o esfomeamento em leucina contribuído particularmente para este fenótipo. A morte induzida pelo amónio em células esfomeadas para aminoácidos essenciais, foi mediada pela vias de regulação PKA, TOR e SCH9, sendo esta morte inicialmente apoptótica seguida por uma extensa necrose secundária. A autofagia, um processo muitas vezes descrito como essencial à sobrevivência durante o esfomeamento em azoto e responsável pela regulação da homeostase de aminoácidos, não parece ter um papel na morte celular induzida pelo amónio. Os resultados com células das estirpes tor1 , tpk1 e sch9 esfomeadas para aminoácidos, mostraram que a toxicidade do amónio é mediada através da sobre-activação das cinases PKA e TOR, e pela inibição da Sch9p, sugerindo que esta última tem uma acção independente da via TORPKA. Verificou-se ainda que a activação da cinase PKA pelo amónio é mediada via Tor1p e Sch9p, porém independente da Mep2p. Não se observou relação significativa entre a toxicidade do amónio e a actividade das enzimas envolvidas no seu metabolismo, indicando que a activação da proteína PKA, através da sinalização pelo amónio, não depende da metabolização deste. Em concordância, verificou-se também que a metilamina, um análogo não metabolizável do amónio, induziu morte celular. Os efeitos tóxicos do amónio foram ainda observados em estirpes prototróficas de S. cerevisiae, indicando que a toxicidade do amónio é um efeito generalizado em células de levedura envelhecidas, não estando dependente apenas de condições de restrição em aminoácidos. Em conclusão, os estudos desenvolvidos no presente trabalho de tese, permitiram identificar, pela primeira vez, o amónio como um factor extrínseco envolvido na regulação da longevidade cronológica de S. cerevisiae, juntando-se, assim, a outros factores já conhecidos como a glucose, o ácido acético e o etanol. Os efeitos da toxicidade do amónio foram ainda caracterizados, também pela primeira vez, em leveduras, demonstrando que este processo possui semelhanças com o descrito para a toxicidade do amónio em células de mamíferos. O modelo de S. cerevisiae apresentado neste trabalho, poderá assim vir a constituir uma importante ferramenta na elucidação de mecanismos conservados e vias envolvidos na toxicidade do amónio, podendo ser útil em diversas áreas de investigação tais como no estudo de doenças associadas à hiperamonémia e na clarificação da regulação da longevidade em organismos multicelulares. Sob o ponto de vista biotecnológico, os resultados obtidos poderão também ser relevantes na definição de estratégias de suplementação de azoto em fermentações alcoólicas, muito em particular no sector vínico.