First molecular and biochemical characterization of the extracellular matrix of Saccharomyces cerevisiae

Abstract

A levedura Saccharomyces cerevisiae, tal como todos os microrganismos, é usualmente considerada como um organismo unicelular. Contudo, os microrganismos formam mais frequentemente comunidades multicelulares macroscópicas que apresentam diferenciação celular, e são coordenadas por um complexo sistema de comunicação, e suportadas por uma matriz extracelular (MEC). A presença deste tipo de suporte das comunidades multicelulares de S. cerevisiae foi descrita no início deste século. Apesar disso, a informação relacionada com a sua composição e organização tridimensional é escassa. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi realizar a primeira abordagem sistemática aos principais componentes da MEC de levedura. Para o efeito, foram desenvolvidas metodologias para (1) obter de forma reprodutível uma considerável e homogénea biomassa de leveduras produtora de MEC, e (2) extrair e fracionar a MEC produzida de forma a obter frações analiticamente puras de proteínas e polissacáridos, compatíveis com a aplicação de metodologias analíticas de alto-débito como o GC-MS e o DIGE. A análise detalhada da fração proteica permitiu a identificação de mais de 600 proteínas. A maioria destas tem função e localização intracelulares, e é aqui identificada extracelularmente pela primeira vez, o que pode indicar um moonlighting surpreendentemente elevado. A presença de todas as enzimas associadas à glicólise e à fermentação, assim como ao ciclo do glioxilato, levanta suspeitas sobre a possibilidade de haver metabolismo extracelular. Além disso, um grande número de proteínas associadas à síntese, remodelação e degradação de outras proteínas foi identificado, incluindo elementos da família HSP70 e várias proteases. De realçar a presença das exopeptidases Lap4, Dug1 e Ecm14, e das metaloproteinases Prd1, Ape2 e Zps1, que partilham um domínio funcional zincin com as metaloproteinases da MEC de Eucariotas superiores. A presença adicional de proteínas intervenientes em várias vias de sinalização, como as Bmh1 e Bmh2, e da homing endonuclease Vde, que partilha o domínio Hedgehog/inteína com os morfogenos de Eucariotas superiores, sugere que a MEC de levedura poderá, tal como nesses organismos, mediar sinalização intercelular. As análises cromatográfica e eletroforética da fração glicosídica revelaram claramente a presença de dois polissacáridos. A análise por espectrometria de massa identificou glucose, manose e galactose na composição destes polissacáridos. Foram ainda observados indícios da presença de ácido urónico. A indução de metacromasia sugeriu que os polissacáridos detetados apresentam substituição química. A possibilidade desta corresponder a sulfatação foi testada através de um teste de atividade anticoagulante. Das diversas amostras de MEC de diferentes estirpes de levedura usadas, o duplo mutante gup1Δgup2Δ apresentou, ao contrário da estirpe Wt, razoável atividade anticoagulante indicadora da presença de grupos sulfato. Os efeitos da deleção do gene GUP1 na composição da MEC de levedura proporcionaram uma perspectiva mais detalhada da composição molecular e mecanismos a ela associados. Observaram-se alterações nas frações protéica e glicosídica. A deleção resultou na ausência de várias proteínas, associadas principalmente com o metabolismo de fontes de carbono, defesa e resgate da célula, bem como síntese, modificação e degradação de proteínas, e organização celular. Adicionalmente, a deleção deste gene também teve um grande impacto na composição glicosídica da matriz, levando ao desaparecimento do polissacárido de maior peso molecular detetado na estirpe Wt. Globalmente, os efeitos da deleção do GUP1 na MEC mostram que a estrutura desta é muito dinâmica e que se encontra sob controlo apertado das células que compõem o agregado multicelular. As funções sugeridas para as proteínas ortólogas das Gup1 e Gup2 de levedura, respetivamente Hhatl e Hhat, nas vias de sinalização de Eucariotas superiores esteve na origem da construção de uma bateria de estirpes de levedura recombinantes transformadas com os ortólogos da via Hedgehog de ratinho, mosca e homem, para futura avaliação. Da mesma forma, foram clonados em S. cerevisiae os recetores de mamífero para o ácido hialurónico (AH), CD44 e HMMR. Estes transformantes foram submetidos ao crescimento na presença de AH de diferentes tamanhos moleculares. As estirpes exprimindo ambos os recetores foram igualmente sensíveis à presença de AH de elevado peso molecular, mas foram diferentemente sensíveis à presença de AH de tamanho molecular intermédio. As células expressando o recetor CD44 mostraram-se, tal como em Eucariotas superiores, sensíveis à presença de AH 50 kDa, apresentando uma forte redução da taxa específica de crescimento. Isto indica a expressão funcional dos recetores de AH em levedura e a provável conservação da maquinaria celular de resposta a este componente da MEC dos Eucariotas superiores. Este trabalho é o primeiro a apresentar um estudo detalhado sobre as frações protéica e glicosídica secretadas para a matriz extracelular de S. cerevisiae durante o seu crescimento em comunidades multicelulares, oferecendo a primeira abordagem proteómica e glicómica da sua composição e organização. Globalmente, este trabalho permite prever que a MEC de levedura exerça funções equivalentes às conhecidas da MEC de Eucariotas superiores.

The yeast Saccharomyces cerevisiae, as all microbes, is generally regarded as a unicellular organism. However, microorganisms live more frequently in macroscopic multicellular aggregates, presenting cellular differentiation, coordinated by complex communication, and supported by an extracellular matrix (ECM). The presence of this type of structure supporting multicellular life-style of S. cerevisiae was first described early this century. However, the information available on the yeast ECM components and three-dimensional spatial organization is scarce. Hence, this work aimed to provide a first methodical insight into the molecular composition of the yeast ECM major components. A methodology was developed capable of reproducibly obtaining ECMproducing homogenous yeast mats, and extracting and fractionating the yeast ECM into analytical-grade fractions. This was developed in order to be fully compatible with the application of high-throughput analytical techniques, like GC-MS and DIGE. The in-depth analysis of the proteins in the yeast ECM identified more than 600 proteins, most of which being ascribed to intracellular functions and localization, and therefore found extracellularly for the first time. This might indicate unexpectedly extensive moonlighting. The entire sets of enzymes from glycolysis and fermentation, as well as gluconeogenesis through glyoxylate cycle were highly represented, raising considerable reason for doubt as whether extracellular metabolism might exist. Moreover, a large number of proteins associated with protein fate and remodelling were found. These included several proteins from the HSP70 family, and proteases, importantly, the exopeptidases Lap4, Dug1 and Ecm14, and the metalloproteinases Prd1, Ape2 and Zps1, sharing a functional zincin domain with higher Eukaryotes ECM metalloproteinases. The further presence of the broad signalling cross-talkers Bmh1 and Bmh2, as well as the homing endonuclease Vde that shares a Hedgehog/intein domain with the Hh morphogens from higher Eukaryotes, suggest that analogously to the tissues in these organisms, yeast ECM is mediating signalling events. The chromatographic and electrophoretic analysis of the sugar fraction revealed the clear presence of two distinct polysaccharides. Mass spectrometry identified glucose, mannose and galactose in their composition. Evidence was also obtained of the presence of uronic acids. Both polysaccharides showed chemical substitution, as indicated by metachromasia, and the existence of sulphate groups was assessed through an anticoagulant activity test. From several ECM samples from different yeasts strains surveyed, the double mutant gup1Δgup2Δ displayed a relatively high anticoagulant activity, which was not observed in Wt, likely related to the presence of sulphate groups. The effects of the deletion of GUP1 gene in the composition of yeast ECM were also assessed, providing a more in-depth perspective of the ECM components and molecular mechanisms associated. Alterations in both protein and sugar fractions were observed. The deletion of GUP1 led to the absence of several ECM proteins, mainly associated with the carbon metabolism, cell rescue and defence, protein fate and cellular organization. Additionally, the disruption of this gene impacted in the composition of the ECM sugar fraction, through the disappearance of the higher molecular weight polysaccharide that had been detected in the Wt sample. The effects of GUP1 deletion on the ECM show that its structure is very dynamic, and that it is under the tight control of the cells composing the aggregate. S. cerevisiae Gup1 and Gup2 orthologues have suggested regulatory roles in the Hedgehog signalling pathway from higher Eukaryotes, in which organisms these proteins are known as Hhatl and Hhat, respectively. This led to the engineering the yeast mutants defective on either or both GUP1 and GUP2 by expressing these genes orthologues from fly, human and mouse, yielding a collection of transformants for future assessment. Similarly, the mammalian receptors of hyaluronic acid (HA), CD44 and HMMR, were cloned into the yeast S. cerevisiae. The engineered strains were subjected to growth in the presence of different molecular sizes of HA, and were identically and differentially sensitive to, respectively, high and intermediate molecular weight HA. The strain expressing CD44 presented a high growth sensitivity to the presence of 50 kDa HA as in high Eukaryotes. The HA receptors are therefore functional in the yeast cell, and the cellular machinery to respond to HA stimuli appears to be fairly conserved. The present work is the first to present a comprehensive detailed study on the protein and polysaccharide fractions secreted during growth in S. cerevisiae multicellular aggregates. Overall, this work gives a first insight of the multicellular communities of S. cerevisiae proteomics and glycomics, ascertaining yeast ECM with putative roles derived from its components that resemble ECM from higher Eukaryotes.