Engineering yeast tolerance to inhibitory lignocellulosic biomass

Abstract

The progressive depletion of fossil fuels reserves in the last years led to the necessity for biotechnological manufacturing based on lignocellulosic feedstocks. Lignocellulosic biomass, such as straw, is an abundant low-cost source for production of biofuels, such as bioethanol, that does not compete for food needs. However, lignocellulose-to-ethanol process involves pre-treatment of biomass to obtain readily fermentable sugars, which leads to the accumulation of inhibitory by-products (e.g. furan derivatives, phenolic compounds, organic acids). Significant progress has been made in the understanding of the determinants of yeast tolerance to lignocellulose biomass-derived inhibitors, as well as to high ethanol concentrations. Nevertheless, further knowledge at the genetic level is of essential importance for the improvement of second generation bioethanol conversion technology. In a previous work, 5 genes, ERG2, PRS3, RAV1, RPB4 and VMA8, were found to contribute to the maintenance of cell viability and/or for maximal fermentation rate in wheat straw hydrolysate. Taking into account the negative effects reported from single overexpression of ERG2, RAV1 and VMA8 under non-stressful conditions, these genes were not considered as good targets for genetic engineering in the present work. Furthermore, ZWF1, a gene essential for yeast response to the presence of acetic acid, was added to the set of genes considered in the present study. To attempt to overcome the fermentation hurdles resultant from the inhibitory load mentioned above, molecular biology tools were used to: (1) unravel HAA1, PRS3 and RPB4 role in adaptation to toxic biomass hydrolysates, evaluating their expression levels, by qRT-PCR, in the outstanding-fermenting Saccharomyces cerevisiae PE-2 when exposed to acetic acid, HMF and furfural, and (2) improve yeast tolerance and adaptation by overexpressing these genes in the auxotrophic S. cerevisiae BY4741, using multi-copy vectors, and assessing the effects in Eucalyptus globulus wood hydrolysate. Increased HAA1, PRS3 and RPB4 expression levels were observed at the late lag and/or initial stationary phases of the fermentation in the presence of inhibitors. However, the overexpression of these genes under the control of the strong constitutive ScPGK1 promoter has not resulted in improved growth and fermentation profiles. On the other hand, the overexpression of HAA1 and PRS3 genes under the regulation of their native promoters resulted in fermentations profiles with a reduced lag-phase. These results indicate that PRS3 and principally HAA1 overexpression play an important role in the adaptation to lignocellulosic-based stress, and are good candidates for yeast engineering to improve bioethanol production.

A diminuição progressiva das reservas de combustíveis fósseis nestes últimos anos levou à necessidade de uma indústria biotecnológica baseada em matérias-primas lenhocelulósicas. A biomassa lenhocelulósica, tal como a palha, é uma fonte abundante de baixo preço para a produção de biocombustíveis, como o bioetanol, que não compete com as necessidades alimentares. Contudo, o processo de conversão de biomassa lenhocelulósica a etanol envolve um pré-tratamento da biomassa para obtenção imediata de açúcares fermentescíveis, levando à acumulação de produtos inibitórios (ex. derivados de furano, compostos fenólicos, ácidos orgânicos). Avanços significativos têm sido efectuados no que concerne à compreensão de determinantes da tolerância de leveduras a inibidores derivados da biomassa lenhocelulósica, tal como a concentrações elevadas de etanol. No entanto, um maior conhecimento a nível genético é essencial para o melhoramento de tecnologias para a conversão de bioetanol de segunda geração. Num trabalho anterior, 5 genes, ERG2, PRS3, RAV1, RPB4 e VMA8 foram identificados como importantes para a manutenção da viabilidade celular e/ou para maximizar a taxa de fermentação em hidrolisados de palha de trigo. Considerando os efeitos negativos reportados da sobre-expressão singular dos genes ERG2, RAV1 e VMA8 na ausência de stress, estes genes foram considerados, neste trabalho, como não sendo bons alvos para engenharia genética. Adicionalmente, o gene HAA1, essencial na resposta à presença de ácido acético em leveduras, foi acrescentado ao conjunto de genes considerado neste estudo. Na tentativa de ultrapassar os problemas fermentativos acima referidos, ferramentas de biologia molecular foram usadas para: (1) desvendar o papel dos genes HAA1, PRS3 e RPB4, na adaptação a hidrolisados de biomassa tóxicos, avaliando os seus níveis de expressão por qRT-PCR, no excepcional organismo fermentativo Saccharomyces cerevisiae PE-2 quando exposto a ácido acético, HMF e furfural, e (2) melhorar a tolerância e adaptação da levedura através da sobre-expressão destes genes na estirpe auxotrófica S. cerevisiae BY4741, usando vectores multi-cópia, e avaliar os efeitos em hidrolisado de madeira de Eucalyptus globulus. Níveis de expressão aumentados dos genes HAA1, PRS3 e RPB4 foram observados no final da fase de adaptação e/ou no inicio da fase estacionária da fermentação na presença de inibidores. Todavia, a sobre-expressão destes genes sob o controlo do promotor constitutivo e forte ScPGK1 não demonstrou um melhoramento dos perfis de crescimento e fermentativos. Em contrapartida a sobre-expressão dos genes HAA1 e PRS3 sob a regulação dos seus promotores nativos resultaram em perfis de fermentação com reduzida fase de adaptação. Estes resultados indicam que a sobre-expressão do PRS3 e principalmente do HAA1 tem um papel importante na adaptação ao stress derivado de biomassa lenhocelulósica, sendo bons candidatos para a engenharia genética de leveduras, de modo a obter melhorias na produção de bioetanol.