Utilize este identificador para referenciar este registo: https://hdl.handle.net/1822/28854

TítuloNew strategies for the production of butanol and 1,3-propanediol from glycerol
Autor(es)Gallardo, R.
Orientador(es)Rodrigues, L. R.
Alves, M. M.
Data17-Dez-2013
Resumo(s)The increasing demand for use of renewable resources as feedstock for the production of chemicals combined with advances in biotechnology is generating a renewed interest in the fermentative production of n-butanol and 1,3-propanediol (1,3-PDO). In this context, glycerol, a by-product of biodiesel and ethanol production, arises as a potential substrate for this purpose. In this work, Clostridium pasteurianum DMS 525 was studied for butanol production using biodiesel-derived crude glycerol and pure glycerol as the carbon source. The main products obtained were butanol and 1,3-PDO. Moreover, the competitive nature of butanol and 1,3-PDO pathways was evident, and a shift to the former for higher glycerol concentrations was clearly observed. In preliminary experiments conducted in serum bottles using crude glycerol, the maximum glycerol consumption achieved was 31.83 ± 0.98 g l-1, which resulted in 6.71 ± 0.42 g l-1 of butanol and 6.86 ± 0.51 g l-1 of 1,3- PDO. To improve the butanol tolerance of C. pasteurianum DSM 525, random chemical mutagenesis (N-ethyl-N-nitrosourea) in solid medium was performed. Experiments resulted in the isolation of colonies growing in culture medium containing 12 g l-1 butanol (except in the controls). Mutant cells showed 20 % higher butanol production than the parent strain when grown in liquid medium. Optimization of the culture medium composition and the inoculum age resulted in a glycerol consumption and a butanol titer of 45.62 ± 3.81 g l-1and 12.4 ± 0.26 g l- 1, respectively. The concentration of 1,3-PDO reached 7.45 ± 0.86 g l-1. In particular, iron was found to play a key role in this process. Supplementation of 3 mg l-1 FeCl2.7H2O in the culture medium led to 140% increase in butanol titer. In pH-controlled experiments, it was possible to increase glycerol consumption to a maximum of 75 g l-1. Nevertheless, butanol production was around 9 g l-1and higher concentrations of 1,3-PDO were obtained (20 g l-1). Finally, the production of 1,3-PDO was studied in continuous culture (EGSB reactors). Two pre-treatments (heat and disruption) were applied to the granular sludge in order to minimize the methane production. 1,3-PDO was always found to be the main product and only small amounts of acids were detected. Molecular biology tools (DGGE, cloning and sequencing) were used to evaluate the microbial community. A maximum 1,3-PDO yield and productivity of 0.43 g g-1 and 57 g l-1d-1, respectively, were achieved in the reactor operated with nontreated granular sludge (control). The results obtained provide a deeper understanding of a complex process such as the anaerobic fermentation of glycerol using Clostridium spp. C. pasteurianum shows a great potential for butanol and 1,3-PDO production from crude glycerol. However, butanol toxicity seriously limits its titer, thus it is important to find ways to overcome this problem. On the other hand, this study proves the feasibility of 1,3-PDO production in EGSB reactors, which have the advantage of being operated under non-sterile conditions and represent a novel strategy to valorise glycerol generated as by-product in the biodiesel industry.
A crescente procura de recursos renováveis como matéria-prima para a produção de químicos combinada com avanços na área da biotecnologia está a gerar um interesse renovado na produção de n-butanol e 1,3-propanodiol (1,3-PDO) por via fermentativa. Neste contexto, o glicerol, sub-produto da produção de biodiesel e etanol, surge como um potencial substrato para esta finalidade. O objectivo desta tese foi estudar e otimizar a produção de butanol por Clostridium pasteurianum DMS 525 utilizando glicerol bruto (derivado da indústria do biodiesel) e glicerol puro como fonte de carbono. Os principais produtos obtidos foram butanol e 1,3-PDO. Adicionalmente, foi possível confirmar a natureza competitiva das vias metabólicas que resultam na produção de butanol e 1,3-PDO, tendo-se verificado claramente uma mudança para a via do butanol nas experiências em que se usaram concentrações mais elevadas de glicerol. Em experiências preliminares conduzidas em frascos utilizando glicerol bruto, o consumo máximo de glicerol foi de 31.83 ± 0.98 g l-1, o que resultou em 6. 71 ± 0.42 g l-1 de butanol e 6.86 ± 0.51 g l-1 de 1,3 - PDO. Para melhorar a tolerância ao butanol do C. pasteurianum DSM 525 realizaram-se ensaios de mutagénese química aleatória (N-etil-N-nitroso-ureia) em meio sólido. Estes ensaios permitiram isolar colónias capazes de crescer em meios 12 g l-1 butanol (com excepção dos controlos). Quando cultivadas em meio líquido, as células mutantes apresentaram uma produção de butanol cerca de 20% mais elevada do que a estirpe-mãe. A otimização da composição do meio de cultura e da idade do inóculo resultou num consumo de glicerol e produção de butanol de 45.62 ± 3.81 g l-1 e 12.4 ± 0.26 g l-1, respectivamente. A concentração de 1,3-PDO atingiu 7.45 ± 0.86 g l-1. Estes ensaios permitiram verificar que o ferro desempenha um papel fundamental neste processo. A suplementação de 3 mg l-1 de FeCl2.7H2O no meio de cultura conduziu a um aumento de cerca de 140% na produção de butanol. Nas experiências conduzidas com controlo de pH, foi possível aumentar o consumo de glicerol até um máximo de 75 g l-1. No entanto, nestas condições a produção de butanol foi de cerca de 9 g de l-1, tendo-se obtido concentrações mais elevadas de 1,3-PDO (20 g l-1). Finalmente, a produção de 1,3-PDO foi estudada em cultura contínua (reactores EGSB). Para minimizar a produção de metano aplicaram-se dois pré-tratamentos (calor e ruptura) à lama granular. Verificou-se que o produto principal em todas as condições avaliadas foi 1,3-PDO tendo sido detetadas apenas pequenas quantidades de ácidos. Adicionalmente, as possíveis alterações na comunidade microbiana nestas condições foram analisadas usando ferramentas de biologia molecular (DGGE, clonagem e sequenciação). Os ensaios realizados no reator operado com lama granular não tratada (controlo) permitiram obter um rendimento e produtividade máxima de 1,3-PDO de 0.43 g g-1 e 57 g l-1d-1, respectivamente. Em suma, os resultados obtidos nesta tese permitiram uma melhor compreensão do processo de fermentação anaeróbica de glicerol usando Clostridium spp. C. pasteurianum demonstrou um grande potencial para a produção de butanol e 1,3- PDO a partir de glicerol em bruto. No entanto, a toxicidade do butanol limita seriamente o seu título. Nesse sentido, é importante encontrar formas de ultrapassar este problema. Por outro lado, esta tese demonstrou a viabilidade da produção de 1,3-PDO em reactores EGSB, sendo que estes reatores têm a vantagem de poderem ser operados sob condições não-estéreis e representam uma nova estratégia para valorizar o glicerol gerado como sub-produto na indústria do biodiesel.
TipoTese de doutoramento
DescriçãoTese doutoramento do Programa Doutoral em Bioengenharia
URIhttps://hdl.handle.net/1822/28854
AcessoAcesso aberto
Aparece nas coleções:BUM - Teses de Doutoramento
CEB - Teses de Doutoramento / PhD Theses

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