A molecular biotechnological approach for the development of silk-elastin-like proteins functionalized with leukemia inhibitory factor

Abstract

Recombinant protein-based polymers (rPBPs) are emerging as a new class of biomaterials due to their unique chemical, physical and biological properties. With the development of protein engineering and biotechnology, we are now able to use amino acids to design and produce genetically engineered rPBPs with precise control over sequence and length. Indeed, recombinant DNA technology allows the design and biosynthesis of multifunctional complex molecules with exquisite control over structure, making it possible to combine in the same polypeptide chain the properties of two or more different proteins. This opens an unprecedented possibility to create novel compositions for specific applications through the manipulation of the genetic sequence. The silk-elastin-like proteins (SELPs) are rPBPs composed of silk- and elastinlike blocks that combine in the same polypeptide chain the properties of silk and elastin, two remarkable natural proteins. The silk-like unit imparts thermal and chemical stability, whereas the elastin-like unit is a flexible component. This endows SELPs with unique properties that can be explored as base material for the production of advanced functional materials. Leukemia inhibitory factor LIF is a pleiotropic cytokine playing several roles in the regulation of differentiation, cell growth and inflammation, and is an important cytokine for normal keratinocyte growth and wound healing. The functionalization of SELPs can therefore be exploited to create a new generation of functional materials with high potential of application in the biomedical field. The present work was performed in the Department of Biology in University of Minho in the scope of the Master Course in Molecular Genetics. By recurring to recombinant DNA technology techniques, murine recombinant LIF was used to functionalize a SELP copolymer. For this, two constructions were performed considering the fusion of LIF to the N- and C-terminal of the SELP chain. The recombinant functionalized SELPs were successfully expressed in Escherichia coli and purified by a simple and non-chromatographic method with high recovery rates. Furthermore, aiming at its subsequent use in drug delivery systems, production and purification of sole LIF was also considered. The recombinant proteins were assessed for their bioactivity in C2C12 cells showing promising results and suggesting that these recombinant proteins could have a high potential of application in the biomedical field.

Polímeros recombinantes de base proteica (rPBPs) apresentam-se como uma nova classe de biomateriais devido às suas singulares propriedades químicas, físicas e biológicas. Com o desenvolvimento da engenharia de proteínas e da biotecnologia, torna-se possível utilizar aminoácidos para construir e produzir polímeros recombinantes de base proteica com um controlo preciso sobre a sua sequência e tamanho. De facto, a tecnologia de DNA recombinante permite a construção e biossíntese de moléculas multifuncionais com controlo sobre a sua estrutura, tornando possível combinar na mesma cadeia polipeptídica as propriedades de duas ou mais proteínas. Este facto possibilita o desenvolvimento de novas composições para aplicações específicas através da manipulação da sequência genética. Proteínas baseadas na seda e elastina (SELPs) são rPBPs compostos por blocos de seda e elastina, que possuem na mesma cadeia polipeptídica as propriedades de ambas as proteínas. Os blocos de seda conferem estabilidade térmica e química e os blocos de elastina conferem flexibilidade. Desta forma SELPs apresentam propriedades únicas que podem ser exploradas para a produção de materiais funcionais. LIF (Leukemia inhibitory factor) é uma citocina pleiotrópica que entre as suas diversas funções, apresenta um papel fundamental na regulação da diferenciação, crescimento celular e inflamação; sendo também importante para o crescimento de queratinócitos e para cicatrização de feridas. A funcionalização de SELPs pode ser explorada de forma a criar uma nova geração de materiais funcionais com grande potencial para ser aplicado em áreas biomédicas. O presente trabalho foi realizado no Departamento de Biologia da Universidade do Minho inserido no Mestrado em Genética Molecular. Recorrendo a técnicas de tecnologia de DNA recombinante, LIF recombinante murina foi utilizada para funcionalizar um SELP. Para tal, duas construções foram realizadas considerando a fusão da LIF no N- e C-terminal da cadeia do SELP. Os SELPs funcionalizados foram expressos com sucesso em Escherichia coli e purificados por um método simples e não cromatográfico, com alta taxa de recuperação. Para além disso, com vista a utilização em sistemas de libertação de fármacos, a produção e purificação de apenas LIF foi considerada. A bioactividade das proteínas recombinantes foi avaliada em células C2C12, mostrando resultados promissores e sugerindo que estas proteínas recombinantes podem ter potencial para serem aplicadas em áreas biomédicas.