Functional characterization of purified vacuoles and evaluation of their role in yeast apoptosis induced by acetic acid

Abstract

The vacuole is the largest organelle of yeast cells and is functionally equivalent to animal lysosome and plant vacuole. Vacuoles are the most acidic organelles of the cell, and play major roles in protein degradation, ion and metabolite storage, as well as in ion homeostasis, response to nutrient deprivation, osmotic and ionic stress, autophagy and even in apoptosis. Lysosome membrane permeabilization and the consequent release of lysosomal proteases, namely cathepsins, are now widely accepted to trigger apoptosis. Of all lysosomal cathepsins, the aspartic cathepsin D was the first identified protein with apoptogenic properties. Acetic acid was shown to induce apoptosis in yeast, associated with changes in mitochondria and release of pro-apoptotic proteins. Pep4p, a vacuolar yeast protease orthologue of the lysosomal human cathepsin D was also shown to be involved in acetic acid-induced apoptosis. The ultimate objective of the present study was to contribute to the understanding of the crosstalk between the vacuole and mitochondria in yeast programmed cell death induced by acetic acid. For these purposes the effect of acetic acid in isolated vacuoles and whole cells with different genetic backgrounds, namely on vacuole membrane permeabilization as well on the release of Pep4p and their relation with alterations in vacuole function, was investigated. The functional characterization of isolated vacuoles as well the effect of acetic acid on vacuolar function was monitored with fluorescent probes combined with flow cytometry and fluorescence microscopy. Functional characterization of isolated vacuoles was also monitored through the activity of V-H+-ATPase by spectrofluorimetry. Epifluorescence microscopy imaging showed that the vacuolar membrane stains strongly with the styryl dye FM1-43 and that most of the vacuoles accumulate Ca2+, as assessed with Fluo-4 AM. Flow cytometry analysis of vacuole samples incubated with these fluorescent probes confirmed a well-defined population of intact and functional vacuoles. Consistently spectrofluorimetric assays with the pH-sensitive probe ACMA suggested that the isolated vacuoles were intact and functional, the vacuolar membrane being able to generate and maintain a pH gradient through a concanamycin A-sensitive V-H+-ATPase. The addition of acetic acid induced the release from the vacuole lumen of an EGFP-Pep4p fusion protein. Changes in fluorescence of vacuoles stained with acridine orange and Fluo-4 AM suggest that the acid induces a transient perturbation of vacuolar pH and Ca2+ release. It has been described that release of Ca2+ is an event involved in cell death, as well as the release of H+ and consequent cytosol acidification. The main novelty of the present study with isolated vacuoles is the finding that acetic acid is able to directly induce a partial permeabilization of the vacuolar membrane, similar to LMP in mammalian cells, without the involvement of other organelles or triggering upstream pathways.

O vacúolo é o maior organelo da levedura e é funcionalmente equivalente ao lisossoma das células animais e ao vacúolo das células vegetais. Este organelo, cujo lúmen tem o pH mais ácido, participa em processos celulares importantes tais como degradação proteica e armazenamento de iões e metabolitos, bem como na homeostase iónica, resposta à privação de nutrientes, stress osmótico e iónico, autofagia e mesmo na apoptose. Sabe-se que a permeabilização da membrana lisossomal (LMP) e a consequente libertação de proteases lisossomais, nomeadamente de catepsinas, induz apoptose. De todas as proteases lisossomais, a catepsina D foi a primeira proteína a ser identificada com propriedades apoptóticas. Foi demonstrado que o ácido acético induz apoptose em leveduras, associada a alterações mitocondriais e à libertação de proteínas pró-apoptóticas. Foi igualmente demonstrado que a protease vacuolar Pep4p, ortóloga da catepsina D humana, está envolvida na apoptose induzida por ácido acético. O presente estudo teve como principal objectivo contribuir para a compreensão da interligação entre o vacúolo e a mitocôndria na morte celular programada induzida por ácido acético na levedura Saccharomyces cerevisiae. Para tal foi investigado o efeito do ácido acético em vacúolos isolados e em células inteiras de leveduras com diferentes backgrounds genéticos, nomeadamente no que respeita à permeabilização da membrana vacuolar bem como à libertação de Pep4p e sua relação com alterações nas funções do vacúolos. A caracterização funcional de vacúolos isolados bem como o efeito da adição de ácido acético na função vacuolar foram realizadas por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência associada à utilização de diferentes sondas fluorescentes. A caracterização funcional dos vacúolos isolados foi complementada pela determinação da actividade da V-H+-ATPase por espectrofluorimetria. Os estudos de microscopia de fluorescência mostraram uma marcação forte da membrana vacuolar com a sonda lipofílica FM1-43 e que a maioria dos vacúolos acumulavam Ca2+ com base na marcação pela sonda Fluo-4 AM. A análise por citometria de fluxo de amostras de vacúolos incubadas com estas sondas fluorescentes evidenciou uma população bem definida de vacúolos intactos e funcionais. Consistentemente os ensaios de espectrofluorimetria com a sonda ACMA, sensível ao pH, sugeriram que os vacúolos isolados se encontravam intactos e funcionais, dado que a membrana vacuolar era capaz de gerar e manter um gradiente de pH através da actividade da bomba V-H+-ATPase, sensível à concanamicina A. A adição de ácido acético promoveu a libertação da proteína de fusão EGFP-Pep4p em vacúolos isolados e induziu variações de fluorescência de vacúolos marcados com laranja de acridina e com Fluo-4 AM indicativas de uma perturbação transitória do pH vacuolar e de uma libertação de Ca2+. Está descrito que a libertação de Ca2+ e de H+, com a consequente acidificação do citosol, está envolvida na morte celular. Estes novos resultados em vacúolos isolados permitem concluir que o ácido acético é capaz de induzir directamente uma permeabilização parcial da membrana vacuolar, semelhante à LMP em mamíferos, sem o envolvimento de outros organelos ou sem a activação de vias a montante.