Harnessing the potential of pluripotent stem cells to develop novel platforms to study human motor neurons in vitro

Abstract

Human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have the capacity to differentiate into all three embryonic germ layers and give rise virtually to any cell type in the body. For this reason, they represent an exciting new approach to unravelling the mechanisms of human embryonic development, for drug discovery and disease modelling in vitro. The unique ability to generate relevant cell types from human pluripotent stem cells (hPSCs) opens the possibility of creating inexhaustible sources of cells that are otherwise not open to study in the human body, especially those from the central nervous system. In line with this, the successful specification of human motor neurons from hPSCs has opened new avenues for the study of motor neuron disorders like ALS, a fatal neurodegenerative disease characterized by progressive demise of motor neurons in the cortex, brainstem and anterior horn of the spinal cord. However, the motor neuron yields from existing differentiation protocols are suboptimal, leading to the generation of populations of mixed progenitor cells and postmitotic neurons. In addition, the current understanding on the survival requirements of human motor neurons remains limited. These are significant hurdles for the generation of neuronal cells in quantities that will allow the prosecution of innovative studies based on motor neurons generated from human pluripotent stem cells. Here, we initially used spinal motor neuron cultures specified from hESCs following an optimized protocol and demonstrated a remarkably high level of ongoing birth of new motor neurons during the ensuing 15 days after the regular 31-day period of motor neuron differentiation. Based on previous rodent studies this finding was unexpected and could represent a significant potential confound for some published studies using cultures differentiated in similar conditions to reveal determinants that alter motor neuron survival. We envisioned taking advantage of the ongoing genesis of motor neurons in two distinct ways. On one hand, to address the problem of insufficient motor neuron yields, we conducted a low-throughput screening study by testing a small collection of 160 bioactive molecules to discover small molecules capable of increasing motor neuron numbers in culture, either by enhancing neurogenesis and/or increasing survival. The Rho-kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 was the only tested compound shown to be capable of robustly increasing motor neuron numbers up to four-fold after 9 days in culture, an effect which was evident in both hESC- and hiPSC-derived motor neuron cultures. The increase in motor neuron numbers was later demonstrated to be associated with the enhancement of progenitor proliferation and motor neuron survival. These effects were likely induced through an unknown ROCK-independent mechanism, since other seven small molecules in the family could not elicit comparable increases in motor neuron numbers. On the other hand, to overcome the potential confound effect of ongoing neurogenesis on motor neuron survival studies we used FACS sorting to purify human motor neurons derived from a HB9::GFP hESC reporter line, based on their cellular characteristics and GFP expression. The resulting nearly pure populations of human motor neurons were used to create an assay for agents with direct effects on motor neuron survival. Y-27632 was successfully applied to expand hESC-derived motor neuron cultures before the FACS sorting procedures, leading to a final increase in total motor neuron yields. Similarly to previous studies employing purified populations of chick and rodent embryonic motor neurons, the purified human motor neurons were demonstrated to be responsive to the survival-promoting actions of specific neurotrophic factors (GDNF, BDNF and CNTF), as well as Y-27362 itself. Therefore, we successfully developed original strategies that allow us to significantly increase motor neuron yields from hPSC-derived cultures and to create a robust survival assay using a pure population of human motor neurons specified from hPSCs. Our findings reveal that Y-27632 might constitute a new powerful tool with invaluable contributions to the study of pluripotent stem-cell derived human motor neurons. Human adipose tissue constitutes an appealing alternative source of stem cells which capture the genetic background of the person from which they are obtained. From fat tissue one can easily isolate adult human adipose-derived stem cells (hADSCs) which can be cultivated in vitro and differentiated to other cell types, though with a more restricted potential than hPSCs. The current knowledge on the survival and expansion requirements of hADSCs is limited and protocols to efficiently drive these cells towards a neuronal lineage still need to be developed. Here, we expanded the study of the effects of Y-27632 on human stem cells and were able to show that Y-27632 does not robustly increase the survival and proliferation of hADSCs, a novel finding which demonstrates that the effects of Y-27632 are likely to be cell-specific. In summary, the different methodological advances reported in this thesis should be of general interest for the preparation of human motor neurons on a large scale and for studies addressing the molecular processes underlying motor neuron genesis, survival and degeneration. The body of knowledge reported in this thesis should be of general importance for researchers using human stem cells to study other neuronal populations and other diseases.

As células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e as células estaminais pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) têm a capacidade de se diferenciar nos três folhetos germinativos embrionários e dar origem virtualmente a qualquer tipo celular existente no organismo. Dessa forma, constitutem uma nova abordagem na descoberta dos mecanismos que regulam o desenvolvimento embrionário humano, na descoberta de novos fármacos e na modelação de patologias in vitro. A capacidade única de gerar tipos celulares de interesse a partir destas células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) cria a possibilidade de serem geradas fontes ilimitadas de células que dificilmente estão acessíveis para estudo no corpo humano, sendo o caso das células do sistema nervoso central. Nesse sentido, a criação com sucesso de neurónios motores humanos a partir de hPSCs tem conduzido a novas avenidas no estudo de doenças do neurónio motor, sendo o caso da Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), uma doença neurodegenerative fatal caracterizada pela morte progressiva de neurónios motores no córtex cerebral, tronco cerebral e corno anterior da medula espinhal. No entanto, o resultado final dos protocolos de diferenciação existentes não são ainda os ideiais, dando origem à formação de populações mistas de células progenitoras neuronais e neurónios motores pós-mitóticos. Para além disso, o conhecimento sobre os requisitos destes neurónios motores para se manterem vivos é ainda escasso. Estes factos no seu conjunto constituem importantes barreiras para a produção de células neuronais em quantidades suficientes que permitam o desenvolvimento de estudos inovadores tendo por base os neurónios motores criados a partir de células estaminais pluripotentes humanas. Neste trabalho, começamos inicialmente por usar culturas de neurónios motores da espinhal medula criados a partir de hESCs, seguindo um protocolo optimizado; e demonstramos níveis consideráveis de génese contínua de neurónios motores durante 15 dias após o período habitual de 31 dias para a diferenciação de neurónios motores. Tendo por base os estudos anteriores usando modelos animais, este achado não era expectável e constituía, de facto, um importante factor de confundimento em estudos onde eram utilizadas culturas de neurónios motores geradas em condições semelhantes para estudar factores que possam afectar a sobrevivência dos neurónios motores. Consideramos então que seria possível tirar partido da criação contínua de neurónios motores através de duas abordagens distintas. Por um lado, no sentido de responder ao problema de produção de neurónios motores em quantidades insuficientes, conduzimos um teste de screening de moléculas em pequena escala, usando cerca de 160 compostos, para tentar encontrar alguma que fosse capaz de aumentar o número de neurónios motores em cultura, através da potenciação do efeito de neurogénese contínua e/ou aumento da sobrevivência neuronal. O inibidor da cinase Rho (ROCK) Y-27632 foi descrito como o único composto testado capaz de aumentar de forma significativa o número de neurónio motores em cultura, com efeito máximo de quadruplicação do número de neurónio motores ao fim de 9 dias em cultura, estando o efeito presente em culturas de neurónios motores geradas a partir de hESCs e hiPSCs. Este aumento no número de neurónios motores em cultura foi mais tarde demonstrado estar associado a uma potenciação da proliferação de células progenitoras, bem como, ao aumento da sobrevivência dos neurónios motores. Estes efeitos alegadamente ocorrem através de um mecanismo desconhecido, muito provavelmente independente da inibição de ROCK, na medida em que, outras sete moléculas da mesma família foram testadas e não foram capazes de originar aumentos semelhantes no número de neurónios motores. Por outro lado, de forma a contornar o potencial efeito de confundimento nos estudos de sobrevivência dos neurónios motores inerente à neurogénese contínua, usamos a tecnologia FACS para isolar neurónios motores humanos criados a partir de uma linha reporter HB9::GFP, com base nas suas características celulares e expressão de GFP. As populações de neurónios motores praticamente puras resultantes foram então usadas para desenvolver um ensaio com o objectivo de testar agentes com efeito directo na sobrevivência dos neurónios motores humanos. Antes do procedimento de FACS, o composto Y-27632 foi usado com sucesso na expansão das culturas de neurónios motores, levando a números mais elevados de neurónios motores obtidos com este procedimento. Em linha com estudos anteriores envolvendo o uso de populações purificadas de neurónios motores embrionários de pinto e roedor, os neurónios motores humanos purificados neste trabalho demonstraram ter capacidade de responder às acções pró-sobrevivência de factores neurotróficos específicos (GDNF, BDNF e CNTF), bem como ao composto Y-27632. Deste modo, consegui desenvolver com sucesso algumas estratégias que permitem aumentar de forma significativa a produção de neurónios motores a partir de culturas derivadas de hPSCs, bem como, criar um ensaio de sobrevivência neuronal robusto, com base em neurónios motores humanos purificados a partir de culturas de neurónios motores. Os nossos achados sugerem que o composto Y-27632 pode constituir uma nova ferramenta poderosa no estudo de neurónios motores humanos criados a partir de células estaminais pluripotentes. O tecido adiposo constitui uma fonte alternativa interessante de células estaminais que retêm o património genético da pessoa de onde são obtidas. A partir da gordura podemos isolar com facilidade células estaminais humanas adultas derivadas da gordura (hADSCs), que podem ser cultivadas in vitro e se diferenciar noutros tipos celulares, apesar do potencial mais restrito quando comparadas com as hPSCs. O conhecimento actual sobre os requisitos de sobrevivência e expansão destas células é ainda limitado e protocolos para a geração eficiente de neurónios a partir destas ainda não foram desenvolvidos. Neste trabalho, ampliamos o estudo dos efeitos da molécula Y-27632 nas células estaminais humanas e fomos capazes de demonstrar que a aplicação do composto Y-27632 não aumenta a proliferação e sobrevivência das hADSCs, um novo achado que ajuda a demonstrar que os efeitos de Y-27632 serão provavelmente específicos consoante o tipo celular em estudo. Em suma, os diferentes avanços metodológicos documentados nesta tese deverão ser de interesse geral na geração de neurónios motores humanos em grande quantidades, bem como, na condução de estudos com vista ao melhor conhecimento dos mecanismos da motoneurogénese, sobrevivência e degeneração. O conjunto de conhecimentos cristalizados nesta tese poderão vir a constituir-se como importantes para outros investigadores que usam células estaminais humanas para estudar outras populações neuronais e outras patologias.